王 東，宋 君，葉先林，雷紹榮，劉文娟，常麗娟，尹 全，張富麗

（四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，四川成都610066）

從1993年國際上發(fā)布《測量不確定度表示指南》到2012年我國發(fā)布新版《測量不確定度評定與表示》（JJF1059.1—2012）超過10 a里，不確定度理論研究與評定實踐在我國得到了長足發(fā)展[1-4]。相對于計量與校準實驗室，不確定度評估在檢測實驗室的應用相對較少，主要原因可能在于檢測實驗室的檢驗報告涉及眾多參數(shù)，測量不確定度的計算非常繁瑣等[5]。

轉(zhuǎn)基因成分定量檢測是國際上主流的轉(zhuǎn)基因檢測方法，它通過測量指數(shù)時期擴增后的外源DNA數(shù)量，然后根據(jù)數(shù)學公式計算出樣品中外源DNA的原始拷貝數(shù)量[6-9]。由于該技術(shù)操作步驟繁多、微量轉(zhuǎn)移液體誤差大、熒光基團易降解等原因，導致實驗室之間檢測結(jié)果差異較大。目前，我國尚未出臺轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量標識閾值[10-11]，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因生物檢測實驗室沒有開展測量不確定度評估工作。近年來，歐盟的轉(zhuǎn)基因生物檢測實驗室摒棄了靈敏度不高的End Point PCR（終點多聚酶鏈式反應）方法，而用靈敏度較高的Quantitative real time PCR（實時定量多聚酶鏈式反應）檢測轉(zhuǎn)基因生物并評估其測量不確定度。國際上轉(zhuǎn)基因生物測量不確定度評估，主要采用Top Down或Bottom Up[12]。

本研究采用Bottom Up途徑，參考《測量不確定度評定與表示》（JJF1059.1—2012）[13]，評估了樣品中轉(zhuǎn)基因大豆（GTS40-3-2）含量的不確定度，以期為轉(zhuǎn)基因生物檢測實驗室不確定度評估提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗以含量為100%的轉(zhuǎn)基因大豆（GTS40-3-2）粉末的DNA梯度稀釋液作為制備工作曲線的DNA模板，以含量約為3%的GTS40-3-2混合粉末（轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2粉末與非轉(zhuǎn)基因大豆粉末按照質(zhì)量比為3∶97的比例均勻混合）作為測試樣品。

1.2 試劑和儀器

植物基因組DNA純化試劑盒和real time PCR Master Mix試劑盒（均購自Tiangen生物技術(shù)有限公司（北京）），超微量分光光度計（Nanodrop1000，Thermo），高速冷凍離心機（Heraeus，Thermo），7500 Real Time PCR system（Applied Biosystem Incorporation，F(xiàn)oster city,USA）等。

1.3 DNA 提取

稱取100%含量的GTS40-3-2粉末和含量約為3%的GTS40-3-2粉末各100 mg，按植物基因組DNA純化試劑盒（Tiangen生物技術(shù)有限公司，北京）說明書分離、純化DNA。

1.4 引物和探針

根據(jù)《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法（GB/T 19495.5—2004）》的附錄A（轉(zhuǎn)基因大豆實時熒光PCR方法）[14]中的引物、探針序列合成引物和探針。

1.5 DNA 梯度稀釋和PCR 反應體系

將分離純化得到的100%含量的GTS40-3-2粉末的DNA濃度，按照1∶5稀釋成5個質(zhì)量濃度梯度：100，20，4，0.8，0.16 ng/μL。將含量約為3%的GTS40-3-2粉末的DNA濃度稀釋成50 ng/μL。取3μL上述DNA稀釋液加入到25μL反應體系：2×Taqman Master mix 12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，探針（10μmol/L）0.5μL，補水至25μL。每個DNA濃度稀釋液做3個平行反應，待測樣品做16個重復測試。在ABI7500型熒光定量PCR儀器上運行反應程序：95℃變性10 min；95℃15 s，60℃1 min，共40次循環(huán)。

2 測量結(jié)果與不確定度評定

根據(jù)實時PCR指數(shù)擴增期的循環(huán)數(shù)閾值（C t值）與基因含量對數(shù)值（lg A）之間的數(shù)學關(guān)系式C t＝m×lg A＋k（A 為內(nèi)源基因（Lectin）或外源基因（GTS40-3-2）的質(zhì)量；C t為儀器檢測到的PCR反應循環(huán)數(shù)閾值；k為工作曲線在y軸的截距；m為工作曲線的斜率），以C t值為縱坐標，以lg A 值為橫坐標，7500 Real Time PCR system儀器自帶軟件自動擬合工作曲線，得到內(nèi)、外源基因含量的線性回歸方程。

將所測樣品外源基因或內(nèi)源基因的C t值代入各自的回歸方程，計算出樣品中內(nèi)源基因或外源基因的質(zhì)量（或拷貝數(shù)）。再根據(jù)公式C＝A外/A內(nèi)×100%（C 為樣品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量（%）；A外為樣品中外源基因的質(zhì)量；A內(nèi)為樣品中內(nèi)源基因的質(zhì)量），計算出樣品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。

2.1 檢測結(jié)果

將GTS40-3-2含量約為3%的測試樣品，進行16次重復測定，結(jié)果列于表1。

表1 測試樣品中GTS40-3-2 含量測定結(jié)果

2.2 內(nèi)、外源基因工作曲線的制備

lectin內(nèi)源基因和GTS40-3-2轉(zhuǎn)化事件片段的工作曲線，由ABI7500 software 2.0軟件自動擬合（表2，3）。lectin內(nèi)源基因工作曲線的回歸方程為y＝-3.414x＋31.604，相關(guān)系數(shù)R2＝0.996；GTS40-3-2轉(zhuǎn)化事件片段工作曲線的回歸方程為y＝-3.457x＋29.732，相關(guān)系數(shù)R2＝0.997。

表2 內(nèi)源基因lectin 工作曲線擬合

表3 GTS40-3-2 工作曲線擬合

2.3 不確定度來源

轉(zhuǎn)基因生物測量的不確定度來源主要有探針標記熒光基團分解、儀器穩(wěn)定性、基因擴增效率偏差等隨機效應。此外，試驗中微量液體轉(zhuǎn)移、移液器定值偏差、內(nèi)外源基因含量與熒光信號（C t值表示）的非線性偏離等都是基因定量分析結(jié)果的不確定度主要來源[15]。

2.4 標準不確定評定

2.4.1 A類標準不確定評定 A類不確定度由各類隨機效應引起，按照Bessel公式計算：

式中，xi為GTS40-3-2每次相對含量測量結(jié)果值；x 為16次重復測量GTS40-3-2相對含量的平均值；n 為測量次數(shù)。

2.4.2 B類標準不確定評定

2.4.2.1 工作曲線讀數(shù)C t值的不確定度 與lg A外對應的響應值C t外對GTS40-3-2工作曲線擬合的標準差，即回歸標準差，按照以下公式計算：

在試樣的測量次數(shù)p＝16時，最小二乘法引入的不確定度分量為：

u（A外）＝10lgA外×ln10×u（lg A）；

u（A外）＝A外×2.303×u（lg A）。

故其相對標準不確定度為：

urelA外＝u（A外）/A外＝2.303×0.010＝0.023。

同理，與lg A內(nèi)對應的響應值C t內(nèi)對內(nèi)源基因lectin工作曲線擬合的回歸標準差為：

內(nèi)源基因工作曲線的不確定度u（C t內(nèi)）分量為：

u（A內(nèi)）＝10lgA內(nèi)×ln10×u（lg A內(nèi)）；

u（A內(nèi)）＝A內(nèi)×2.303×u（lg A內(nèi)）。

故其相對標準不確定度為：

urelA內(nèi)＝u（A內(nèi)）/A內(nèi)＝2.303×0.016＝0.037。

按照統(tǒng)計原理計算得到工作曲線的不確定度，其自由度為n-2。故，νA外＝n-2＝15-2＝13；νA內(nèi)＝n-2＝15-2＝13。

不同量程的移液器在加樣過程中具有測量的獨立性，因此，微量移液器允差帶來的合成相對不確定度為：

2.4.2.3 B類標準不確定度的合成 B類不確定度各分量urel外，urel內(nèi)，urel移液器彼此獨立，其靈敏系數(shù)都為1，3個合成為B類標準不確定度為：

3 合成不確定度u rel

因為A類標準不確定度和B類標準不確定度彼此獨立，故：

4 擴展不確定度U

U＝k×uc，包含因子k 為置信水準（P）95%，自由度νeff為198的t 分布臨界值，按非整ν 內(nèi)插計k為1.96，故U＝1.96×0.002＝0.016≈0.02。

所以，測量結(jié)果C＝0.028±0.02。

5 討論

測量不確定度是衡量實驗室檢測質(zhì)量的重要尺度，一般來說不確定度越小，檢測結(jié)果與約定真值越靠近，檢測質(zhì)量越高；但不確定度過小，在實驗室間的數(shù)據(jù)比對時，往往造成比對數(shù)據(jù)離群[5]。被測量的不確定度取決于各輸入量的不確定度，在評估測量結(jié)果的不確定度時，應先評定各分量的不確定度。本研究用Bessel公式估算16次重復測量GTS40-3-2含量結(jié)果的A類不確定度（uA＝0.000 8）。由于轉(zhuǎn)基因生物檢測體系一般是微量體系（50μL以內(nèi)），移液誤差對檢測結(jié)果影響較大；此外，數(shù)據(jù)對之間的非線性偏離會影響工作曲線的擬合。在B類不確定評估中，重點估算了內(nèi)源基因（Lectin）、外源基因（GTS40-3-2）工作曲線的不確定度（urelA內(nèi)＝0.037，urelA外＝0.023）以及反應體系（25μL）制備中微量液體轉(zhuǎn)移的不確定度（urel移液器＝0.07）。在此基礎(chǔ)上，計算出合成了所有分量不確定度的合成不確定度（uC＝0.002）。在95%的置信水平下（νeff＝198，k＝1.96），計算出擴展不確定度（U＝0.02）。測量結(jié)果（C＝0.028±0.02）接近約定真值（0.03），測量不確定相對較小，說明轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2檢測質(zhì)量較高。

從各分量的不確定度看，微量液體轉(zhuǎn)移引入的不確定度最大（0.07）。因此，在今后的測試中應重點注意微量液體轉(zhuǎn)移量的準確性，尤其應重視移液器的校準。在實驗操作中，應選用與移液器匹配較好、液體低吸附（low binding）的槍頭，盡量降低移液器帶來的不確定度。在轉(zhuǎn)基因生物檢測過程中，不同環(huán)節(jié)都可能產(chǎn)生不確定度[16]，如送樣種子顆粒數(shù)量與期望含量、樣品縮分、DNA分離及其濃度測量、DNA溶液稀釋、反應體系制備、熒光基團降解、工作曲線擬合等。本研究重點討論了轉(zhuǎn)基因生物檢測中微量液體的轉(zhuǎn)移和工作曲線引入的不確定度，是對轉(zhuǎn)基因成分檢測結(jié)果不確定度評定的初步嘗試，而在實際測試中，應盡可能多地對從制樣到數(shù)據(jù)分析等各個環(huán)節(jié)的不確定度進行評估，從而獲得較準確的測量不確定度。

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