張文軍，李蘇梅，張海波，張慶波，張改云，張光濤，朱義廣，張長生

中國科學(xué)院南海海洋研究所海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

海洋微生物研究中心 廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510301

放線菌是發(fā)現(xiàn)微生物藥物的一個(gè)重要源泉。在迄今報(bào)道的13000 多個(gè)有生物活性的代謝產(chǎn)物中，超過70%的來源于放線菌［1］。在過去的幾十年中，微生物藥物的研究主要集中于陸生放線菌，尤其是鏈霉菌。然而，隨著研究工作的持續(xù)進(jìn)行，從中分離得到的代謝產(chǎn)物的重復(fù)率逐年增加，開發(fā)新的微生物資源越來越具有必要性。高溫、低壓、寡營養(yǎng)的海洋環(huán)境中生活的海洋放線菌形成了獨(dú)特的代謝途徑，從而具備了生產(chǎn)新的次級代謝產(chǎn)物的潛力［2］。在過去的十年中，從海洋放線菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了包括salinosporamides、sporolides、cyanosporasides 等在 內(nèi)的一系列結(jié)構(gòu)新穎、生物活性獨(dú)特的次級代謝產(chǎn)物［3］。最近，中國科學(xué)院南海海洋研究所的科研人員從源于南?；蛘哂《妊蠛５壮练e環(huán)境的放線菌中發(fā)現(xiàn)了一系列具有抗菌、抗瘧原蟲和抗腫瘤活性的次級代謝產(chǎn)物［4-6］。本課題組在對南海放線菌的持續(xù)研究中，發(fā)現(xiàn)源自南海沉積物的小單孢菌Micromonospora rosaria SCSIO N160 能產(chǎn)生抗菌活性的次級代謝產(chǎn)物，對其發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，得到了四個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素rosamicin(1)、6108B(2)、M4365-A1(3)和M4365-G1(4)。本文報(bào)道了Micromonospora rosaria SCSIO N160 的發(fā)酵及化合物1～4 的分離與結(jié)構(gòu)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

核磁共振波譜1H NMR、13C NMR 用Bruker DRX2500 核磁共振儀(500/125 MHz)測定，以TMS為內(nèi)標(biāo)，CDCl3、CD3OD 作溶劑;質(zhì)譜ESI-MS 用LCQ DECA XP 液質(zhì)聯(lián)用儀，以CHCl3、CH3OH 作溶劑測定。正相用硅膠為100～200 目和300～400 目硅膠(中國煙臺)，凝膠為Sephadex LH-20(40～70 μm;Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)，反相硅膠為YMC* GEL ODS-A(12 nm S-50μm;Japan)。薄層層析用硅膠G(silica gel GF254，10～40 nm，煙臺)。

1.1.2 菌種

菌株SCSIO N160 分離自深30 m 的南海海底沉積物樣品(東經(jīng)116°17.754'，北緯22°41.083')，經(jīng)16S rRNA 基因序列(JF508525)鑒定為小單孢菌Micromonospora rosaria ，保藏于中國科學(xué)院南海海洋研究所海洋微生物研究中心。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:酵母膏0.4%，葡萄糖0.4%，麥芽浸膏0.5%，瓊脂1.8～2.0%，海鹽3%，復(fù)合維生素(VB1 0.1 mg，VB6 0.1 mg，核黃素0.1 mg，煙酸0.1 mg，苯丙氨酸0.1 mg，生物素0.1 mg，丙氨酸0.03 mg)，pH 7.2。

種子和發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉1%，葡萄糖2%，酵母粉1%，玉米粉0.3%，牛肉膏0.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO40.05%，CaCO30.2%，海鹽3%;pH 7.2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的發(fā)酵

將菌種接種至斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)14 d，接種于種子培養(yǎng)基中，28 ℃，200 rpm 振蕩培養(yǎng)6 d作為發(fā)酵培養(yǎng)的種子，將生長良好的種子以10%(v/v)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(400 mL 培養(yǎng)基/2000 mL 三角瓶)，28 ℃，200 rpm 培養(yǎng)4 d，加入XAD-16 大孔樹脂，24 h 后收集大孔樹脂備用。

1.2.2 提取與分離

收集大孔樹脂，用4 L 水洗脫鹽，后用丙酮洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收丙酮，水相用丁酮萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)丁酮萃取液得到4 g 粗品。粗品用氯仿(C):甲醇(M)溶解拌樣上硅膠柱(100～200 目)，C:M 線性梯度洗脫，收集餾份，結(jié)合HPLC 分析，抑菌活性檢測合并餾份，得4 個(gè)餾份Fr.1-Fr.4，F(xiàn)r.2 上Sephadex LH20，C:M 洗脫收集餾份，結(jié)合HPLC 分析，抑菌活性檢測合并餾份，得餾份Fr.2-A—Fr.2-H，餾份Fr.2-C 上中壓液相柱，甲醇:水線性梯度洗脫得到rosamicin(1)，餾份Fr.2-D 上中壓液相柱，甲醇:水線性梯度洗脫得到6108B(2)，餾份Fr.2-E 用高壓液相制備，流動(dòng)相為乙腈:水，制備得M4365-A1(3)，餾份Fr.2-F 用高壓液相制備，流動(dòng)相為乙腈:水，制備得M4365-G1(4)。

2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1～4 的結(jié)構(gòu)(圖1)通過對ESI-MS、1H NMR、13C NMR 的分析及與參考文獻(xiàn)比較來確定。

圖1 化合物1～4 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-4

化合物1 白色粉末，ESI-MS m/z 582 ［M +H］+，604 ［M + Na］+，確定其分子量為581。結(jié)合1H NMR 和13C NMR 分析，確定其分子式為C31H51NO9。1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ :9.72 (1H，s，H-20)，6.54 (1H，d，J=16.0 Hz，H-11)，6.44 (1H，d，J =16.0 Hz，H-10)，4.87 (1H，m，H-15)，4.22 (1H，d，J=7.5 Hz，H-1')，3.90 (1H，br d，J =10.0 Hz，H-3)，3.70 (1H，br d，J = 10.0 Hz，H-5)，3.45(1H，m，H-5')，3.19 (1H，dd，J =10.0，7.5 Hz，H-2')，3.07 (1H，m，H-19a)，2.82 (1H，d，J=9.0 Hz，H-13)，2.65 (1H，dd，J = 17.0，10.0 Hz，H-2a)，2.56 (1H，m，H-8)，2.43～2.47 (3H，m，H-6，H-19b，H-3')，2.27 (6H，s，H-7'，H-8')，2.09 (1H，d，J =10.5 Hz，H-2b)，1.76-1.82 (2H，m，H-16a，H-4)，1.63-1.72 (2H，m，H-7，H-4' a)，1.48-1.54(2H，m，H-14，H-16b)，1.42 (3H，s，H-22)，1.24(1H，m，H-4'b)，1.19 (3H，d，J =9.0 Hz，H-6')，1.15 (3H，d，J =7.0 Hz，H-21)，1.14 (3H，d，J =2.5 Hz，H-23)，1.12 (3H，d，J = 7.5 Hz，H-18)，0.88 (3H，d，J =7.0 Hz，H-17);13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ :173.4 (C，C-1)，39.6 (CH2，C-2)，66.7 (CH，C-3)，41.2 (CH，C-4)，81.1 (CH，C-5)，31.1 (CH，C-6)，31.7 (CH2，C-7)，37.8 (CH，C-8)，200.4 (C，C-9)，122.7 (CH，C-10)，150.9 (CH，C-11)，59.7 (C，C-12)，67.9 (CH，C-13)，45.1(CH，C-14)，76.8 (CH，C-15)，24.7 (CH2，C-16)，8.9 (CH3，C-17)，9.0 (CH3，C-18)，43.7 (CH2，C-19)，203.1 (CH，C-20)，17.4 (CH3，C-21)，15.0(CH3，C-22)，14.5 (CH3，C-23)，104.3 (CH，C-1')，70.3 (CH，C-2')，65.7 (CH，C-3')，28.4 (CH2，C-4')，69.6 (CH，C-5')，21.1 (CH3，C-6')，40.2(CH3，C-7'，8')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致［7，8］，故將化合物1 鑒定為rosamicin。

化合物2 白色粉末，ESI-MS m/z 598 ［M +H］+，620 ［M + Na］+，提示其分子量為597。結(jié)合1H NMR 和13C NMR 分析，確定其分子式為C31H51NO10。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ :8.37 (1H，s，H-20)，6.73 (1H，d，J=15.7 Hz，H-11)，6.48 (1H，d，J =15.7 Hz，H-10)，4.86 (1H，m，H-15)，4.31(1H，d，J=6.6 Hz，H-1')，3.97 (1H，br d，J=10.0 Hz，H-3)，3.78 (1H，br d，J =10.0 Hz，H-5)，3.43-3.49 (2H，m，H-19a，H-5')，3.65 (1H，m，H-13)，2.93 (1H，m，H-2')，2.92 (1H，m，H-6)，2.87 (1H，m，H-19b)，2.86 (6H，s，H-7'，8')，2.67 (1H，m，H-8，H-3')，2.38 (1H，d，J = 17.0 Hz，H-2a)，2.29(1H，d，J =17.0 Hz，H-2b)，2.03 (1H，d，J =11.0 Hz，H-4)，1.84-1.97 (3H，m，H-16a，H-4'a，H-7)，1.79 (1H，m，H-14)，1.56(1H，m，H-16b)，1.50(3H，s，H-22)，1.47 (1H，m，H-4'b)，1.33 (3H，d，J=6.0 Hz，H-6')，1.20 (3H，d，J =7.0 Hz，H-21)，1.15 (3H，d，J =6.0 Hz，H-23)，1.10 (3H，d，J =6.0 Hz，H-18)，0.93 (3H，J =7.0 Hz，H-17);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ :174.0 (C，C-1)，41.0(CH2，C-2)，67.4 (CH，C-3)，42.7 (CH，C-4)，82.2(CH，C-5)，32.5 (CH，C-6)，34.5 (CH2，C-7)，39.1(CH，C-8)，203.4 (C，C-9)，124.5 (CH，C-10)，152.5 (CH，C-11)，61.2 (C，C-12)，69.0 (CH，C-13)，46.6 (CH，C-14)，78.0 (CH，C-15)，25.6(CH2，C-16)，9.4 (CH3，C-17)，9.6 (CH3，C-18)，39.1 (CH2，C-19)，174.0 (C，C-20)，17.6 (CH3，C-21)，15.3 (CH3，C-22)，14.7 (CH3，C-23)104.6(CH，C-1')，70.3 (CH，C-2')，66.9 (CH，C-3')，31.2 (CH2，C-4')，69.6 (CH，C-5')，21.0 (CH3，C-6')，41.1 (CH3，C-7'，8')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致［7］，故將化合物2 鑒定為6108B(2)。

化合物3 白色粉末，ESI-MS m/z 568 ［M +H］+，590 ［M + Na］+，提示其分子量為567。結(jié)合1H NMR 和13C NMR 分析，確定其分子式為C31H53NO8。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ :6.71 (1H，J=15.6 Hz，H-11)，6.45 (1H，J =15.7 Hz，H-10)，4.82 (1H，m，H-15)，4.36 (1H，d，J =6.0 Hz，H-1')，3.83 (1H，m，H-5)，3.80 (1H，m，H-3)，3.62-3.70 (2H，m，H-5'，H-2')，3.43-3.47 (2H，m，H-19a，H-13)，2.89 (6H，m，H-7'，H-8')，2.85 (1H，m，H-3')，2.61-2.67 (2H，m，H-19b，H-8)，2.29(1H，m，H-2)，2.06 (1H，m，H-2)，1.83-1.92 (4H，m，H-6，H-4'a，H-7，H-16a)，1.76 (1H，m，H-4)，1.67 (1H，m，H-14)，1.54 (1H，m，H-4'b)，1.49(3H，s，H-22)，1.43 (1H，m，H-16b)，1.19 (3H，d，J=7.0 Hz，H-6')，1.14 (3H，d，J =7.0 Hz，H-23)，1.11 (3H，J=7.0 Hz，H-18)，0.89 (3H，t，J =7.0 Hz，H-20);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ :174.4(C，C-1)，41.3 (CH2，C-2)，67.3 (CH，C-3)，46.7(CH，C-4)，81.0 (CH，C-5)，42.3 (CH，C-6)，34.1(CH，C-7)，49.0 (CH，C-8)，203.9 (C，C-9)，125.6(CH，C-10)，152.1 (CH，C-11)，61.2 (C，C-12)，69.3 (CH，C-13)，40.6 (CH，C-14)，78.1 (CH，C-15)，22.2 (CH2，C-16)，9.5 (CH3，C-17)，9.9(CH3，C-18)，25.6 (CH2，C-19)，12.5 (CH3，C-20)，17.0 (CH3，C-21)，15.3 (CH3，C-22)，14.6(CH3，C-23)，104.7 (CH，C-1')，70.4 (CH，C-2')，67.1 (CH，C-3')，31.2 (CH，C-4')，69.6 (CH，C-5')，21.1 (CH3，C-6')，39.1 (CH3，C-7'，8')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致［9，10］，故將化合物3 鑒定為M-4365 A1。

化合物4 白色粉末，ESI-MS m/z 552 ［M +H］+，574 ［M + Na］+，提示其分子量為551。結(jié)合1H NMR 和13C NMR 分析，確定其分子式為C31H53NO7。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ :7.26 (1H，d，J=15.0 Hz，H-11)，6.46 (1H，d，J =15.0 Hz，H-10)，5.69 (1H，d，J =10.0 Hz，H-13)，4.71 (1H，m，H-15)，4.33 (1H，d，J = 5.0 Hz，H-1')，3.81(1H，br d，J=9.0 Hz，H-3)，3.74 (1H，d，J =10.0 Hz，H-5)，3.67 (1H，m，H-5')，3.42-3.44 (1H，br s，H-19a，H-2')，2.90 (1H，s，H-7')，2.81 (1H，s，H-8')，2.66 (1H，m，H-3')，2.52 (1H，m，H-8)，2.30(1H，br s，H-2)，2.04～2.07 (2H，m，H-2，H-19b)，1.87 (3H，s，H-22)，1.74-1.79 (3H，m，H-16a，H-14，H-6)，1.61～1.64 (2H，m，H-7，H-4'a)，1.45-1.47 (3H，m，H-4，H-16b，H-4'b)，1.30 (3H，s，H-6')，1.22 (3H，d，J =7.0 Hz，H-21)，1.10 (3H，d，J=6.5 Hz，H-23)，1.06 (3H，d，J=7.0 Hz，H-18)，0.96 (3H，t，J =7.5 Hz，H-20)，0.88 (3H，t，J =7.0 Hz，H-17);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ :175.0 (C，C-1)，41.2 (CH，C-2)，68.4 (CH，C-3)，46.5 (CH，C-4)，80.9 (CH，C-5)，40.1 (CH，C-6)，34.9 (CH，C-7)，49.0 (CH，C-8)，203.8 (C，C-9)，120.5 (CH，C-10)，149.7 (CH，C-11)，134.9 (CH，C-12)，147.8 (CH，C-13)，37.5 (CH，C-14)，80.1(CH，C-15)，22.2 (CH2，C-16)，9.6 (CH3，C-17)，10.0 (CH3，C-18)，25.7 (CH2，C-19)，12.5 (CH3，C-20)，17.9 (CH3，C-21)，16.3 (CH3，C-22)，13.1(CH3，C-23)，104.5 (CH，C-1')，70.4 9 (CH，C-2')，67.1 (CH，C-3')，31.3 (CH，C-4')，69.2 (CH，C-5')，21.1 (CH3，C-6')，42.4 (CH，C-7'，8')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致［9，10］，故將化合物4 確定為M4365-G1。

Rosamicin 具有廣譜抗菌活性，尤其對于G+菌Staphylococcus aureus 和Diplococcus pneumoniae 有顯著的抑制活性。Rosamicin 首次由Wagman 等從Micromonospora rosaria IFO 13697 (NRRL No.3718)發(fā)酵液中分離得到。1990 年，Mohindar 等和Shigeru等分別報(bào)道了rosamicin 的數(shù)個(gè)同系物［7，9］。本文是首次報(bào)道從海洋來源的放線菌在高鹽的培養(yǎng)條件下得到rosamicin(1)及其同系物6108B(2)，juvenimicin A2(3)和M4365-G1(4)。

致謝:非常感謝南海海洋研究所的李傳榮老師、肖志慧老師及孫愛君老師在核磁數(shù)據(jù)方面提供的幫助，同時(shí)感謝華南植物園的劉儉老師在質(zhì)譜數(shù)據(jù)方面提供的幫助。

1 Berdy J. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot，2005，58:1-26.

2 Jensen PR，Gontang E，Mafnas C，et al.Culturable marine actinomycete diversity from tropical Pacific Ocean sediments.Environ Microbiol，2005，7:1039-1048.

3 Fenical W，Jensen PR，Palladino MA，et al. Discovery and development of the anticancer agent salinosporamide A(NPI-0052).Bioorg Med Chem，2009，17:2175-2180.

4 Zhang QB，Mándi A，Li SM，et al. N-N-coupled indolo-sesquiterpene atropo-diastereomers from a marine-derived actinomycete.Eur J Org Chem，2012，27:5256-5262.

5 Li SM(李蘇梅)，Tian XP(田新朋)，Niu SW(牛四文)，et al. Antimycins from marine Streptomyces sp. SCSIO 1635 from the South China Sea.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2011，23:10-14.

6 Zhang WJ，Liu Z，Li SM，et al. Spiroindimicins A-D:new bisindole alkaloids from a Deep-Sea-Derived actinomycete.Org Lett，2012，14:3364-3367.

7 Nakajima S，Kojiri K，Morishima H，et al.New analogs of rosaramicin isolated from a Micromonospora strain.II.Structure determination.J Antibiot，1990，43:1006-1009.

8 Anzai Y，Sakai A，Li W，et al. Isolation and characterization of 23-O-mycinosyl-20-dihydro-rosamicin:a new rosamicin analogue derived from engineered Micromonospora rosaria. J Antibiot，2010，63:325-328.

9 Puar MS，Schumacher.Novel macrolides from Micromonospora rosaria.J Antibiot，1990，43:1497-1501.

10 Kinumaki A，Harada KI，Suzuki T，et al.Macrolide antibiotics M-4365 produced by Micromonospora. II. Chemical structures.J Antibiot，1977，30:450-454.