于 翾，曹曉云

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

鹽酸環(huán)丙沙星乳膏用于治療膿瘡、癤腫、毛囊炎、濕疹并發(fā)感染等化膿性皮膚感染，按《中國藥典》要求應(yīng)進(jìn)行無菌檢查。本品無菌檢查方法的難點(diǎn)在于如何消除鹽酸環(huán)丙沙星的抑菌作用，由于鹽酸環(huán)丙沙星乳膏為凡士林基質(zhì)乳膏，含有液體石蠟、十八醇、白凡士林、甘油、單硬脂酸甘油酯、聚乙二醇400、聚山梨酯80和二甲基亞砜等多種輔料，為采用薄膜過濾法消除鹽酸環(huán)丙沙星的抑菌作用，本文探討了多種溶解稀釋體系制備供試溶液，試驗(yàn)建立了鹽酸環(huán)丙沙星乳膏的無菌檢驗(yàn)方法，并按《中國藥典》2010 年版要求進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定。用選定方法對三個(gè)廠家的樣品進(jìn)行無菌檢查，方法可行，所建立的方法適用于鹽酸環(huán)丙沙星乳膏的無菌檢查。

1 試驗(yàn)材料

1.1 培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(批號(hào)120521)、改良馬丁培養(yǎng)基(批號(hào)120522)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)120626)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)120529)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)120113)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)120510)，均為北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］、大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］、生孢梭菌(Clostridiun sporogenes)［CMCC(B)64941］、白色念珠菌(Clostridium sporogenes)［CMCC(F)98001］和黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98003］，均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 樣品 鹽酸環(huán)丙沙星乳膏由廣東順峰藥業(yè)有限公司(批號(hào)20090201)、海南碧凱藥業(yè)有限公司(批號(hào)20100201)和廣州白云山制藥股份有限公司(批號(hào)P1023)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)菌液的制備 按照《中國藥典》2010 年版二部附錄XI H 無菌檢查法項(xiàng)下方法制備。

2.1.1 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、生孢梭菌 取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物少許接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18 h。取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)18 h 的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌肉湯培養(yǎng)物1 ml，加9 ml 的0.9%無菌氯化鈉溶液，以10 倍稀釋至約10-5～10-7，混勻備用。取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)18 h 的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基培養(yǎng)物1 ml，加9 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，以10 倍稀釋至約10-5～10-7，混勻備用。

2.1.2 白色念珠菌 取白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)24 h。取該培養(yǎng)物1 ml，加9 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，以10 倍稀釋至約10-5～10-7，混勻備用。

2.1.3 黑曲霉 將黑曲霉新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，使大量孢子成熟。取該培養(yǎng)物加0.9%無菌氯化鈉溶液4 ml 洗下孢子，吸出轉(zhuǎn)移至空無菌試管作為原菌液，以10 倍稀釋至約10-4～10-5，混勻備用。

各試驗(yàn)菌菌液濃度每1 ml 含10 ～100 cfu，平板計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。各驗(yàn)證菌結(jié)果均符合《中國藥典》要求。

表1 試驗(yàn)菌計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 真菌檢查方法及驗(yàn)證試驗(yàn) 由于鹽酸環(huán)丙沙星乳膏中含有多種基質(zhì)，常規(guī)方法不容易得到溶液型供試液，采用薄膜過濾法有一定困難，故考慮使用直接接種法進(jìn)行鹽酸環(huán)丙沙星乳膏的真菌檢查。采用直接接種法，取改良馬丁培養(yǎng)基2 瓶，每瓶培養(yǎng)基裝量為500 ml，分別接入白色念珠菌和黑曲霉的適宜稀釋級(jí)菌液(＜100 cfu)，以上2 瓶分別加入每1 ml 中含0.2 g 的供試液25 ml，由于接入供試品的培養(yǎng)基呈渾濁狀態(tài)，按規(guī)定溫度培養(yǎng)5 d 后，取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2 ～3 d。結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)菌生長情況

2.3 細(xì)菌檢查的方法及驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)——直接接種法 鹽酸環(huán)丙沙星乳膏屬于喹諾酮類抗生素，為消除其抑菌作用，嘗試在滿足《中國藥典》要求最低取樣量條件下，通過降低取樣量、加入適宜中和劑和增加培養(yǎng)基用量的方法，消除抑菌作用。參照文獻(xiàn)選用0.1 mol/L 硫酸錳溶液作為中和劑［1］。取0.5 g 鹽酸環(huán)丙沙星乳膏，與5 g 的聚山梨酯80 充分研磨混合均勻，加入0.1 mol/L 硫酸錳溶液稀釋至10 ml，振搖使均勻分散，作為供試液。取供試液10 ml 直接接種至500 ml 培養(yǎng)基中，加入規(guī)定量的陽性對照菌，培養(yǎng)相應(yīng)天數(shù)后轉(zhuǎn)種，轉(zhuǎn)種后各驗(yàn)證菌并未在規(guī)定時(shí)間內(nèi)生長，該方法不能消除鹽酸環(huán)丙沙星的抑菌作用，不能滿足無菌檢查要求。

2.3.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)——薄膜過濾法 鹽酸環(huán)丙沙星乳膏中含有多種基質(zhì)，為采用薄膜過濾法消除鹽酸環(huán)丙沙星的抑菌作用，嘗試了多種供試液制備方法。以《中國藥典》2010 年版常用稀釋液0.1%蛋白胨水溶液、pH 7.0 氯化鈉- 蛋白胨緩沖液、含1% 聚山梨酯80 的0.1%蛋白胨水溶液和含1%聚山梨酯80 的pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液制備供試液時(shí)，溶液均呈混懸狀態(tài)，無法采用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查。采用十四烷酸異丙酯為稀釋劑制備供試液，可得到透明溶液，但經(jīng)薄膜過濾法處理時(shí)，供試液堵塞濾膜，不能過濾;曾以聚山梨酯80 與供試品充分研磨，再加十四烷酸異丙酯進(jìn)行稀釋，所得供試液仍不能進(jìn)行薄膜過濾。綜合上述不同體系制備的供試液，采用離心或靜置沉淀的方法，取上清液進(jìn)行薄膜過濾。其中，取10 g 鹽酸環(huán)丙沙星乳膏，與聚山梨酯80 混合均勻，再加無菌十四烷酸異丙酯溶解稀釋，靜置30 min，取上清液作為供試液，進(jìn)行薄膜過濾法，經(jīng)過不同沖洗液沖洗，各驗(yàn)證菌在規(guī)定時(shí)間內(nèi)生長，該方法符合《中國藥典》規(guī)定。

2.3.3 薄膜過濾法及方法驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.3.1 無菌檢查方法 取本品，加4 倍量聚山梨酯80 研磨均勻，加無菌十四烷酸異丙酯混合均，使成每1 ml 中含25 mg 的溶液，作為供試品溶液。取供試品溶液40 ml，靜置30 min 后取上清液20 ml，采用薄膜過濾法處理，結(jié)果較為理想。由于鹽酸環(huán)丙沙星乳膏基質(zhì)溶解于十四烷酸異丙酯中，供試液過濾后如果以水溶液沖洗濾膜，基質(zhì)會(huì)析出成為絮狀沉淀，堵塞濾膜，故先用無菌十四烷酸異丙酯分4 次沖洗(每膜不少于200 ml)，再用含1%聚山梨酯80 的0.1%無菌蛋白胨水溶液分次沖洗(每膜不少于800 ml)，注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100 ml。依上述方法以聚山梨酯80和十四烷酸異丙酯制備的供試液，在每張濾膜上的過濾量有限，為減少濾膜的堵塞，靜置后取半量上清液過濾，應(yīng)考慮采用多膜過濾保證滿足《中國藥典》最少檢驗(yàn)量要求。本品以大腸埃希菌為陽性對照菌［2，3］，依法檢查(《中國藥典》2010 年版二部附錄ⅪH)。

2.3.3.2 方法驗(yàn)證試驗(yàn) ①供試品組:取本品1 g，與4 g 聚山梨酯80 研磨均勻，加無菌十四烷酸異丙酯至40 ml，混合均勻，制成每1 ml 中含25 mg 的溶液。靜置30 min 后取上清液20 ml，采用薄膜過濾法處理，先用無菌十四烷酸異丙酯分4 次沖洗(每膜不少于200 ml)，再用含1%聚山梨酯80 的0.1%無菌蛋白胨水溶液分次沖洗(每膜不少于800 ml)，在最后一次沖洗液中加入少于100 cfu 的需驗(yàn)證試驗(yàn)菌，濾干后，注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100 ml。②陽性對照:另取一裝有同體積的培養(yǎng)基容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對照。按規(guī)定溫度培養(yǎng)3 ～5 d。各試驗(yàn)菌同法操作。③陰性對照:硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基無菌性檢查應(yīng)符合規(guī)定。④各驗(yàn)證菌結(jié)果均符合《中國藥典》要求。見表2。

2.4 樣品檢驗(yàn) 取本品，與4 倍量聚山梨酯80 研磨均勻，加無菌十四烷酸異丙酯混合均勻使成每1 ml 中含25 mg 溶液，作為供試品溶液。取供試品溶液40 ml，靜置30 min 后取上清液20 ml，采用薄膜過濾法處理，先用無菌十四烷酸異丙酯分4 次沖洗(每膜不少于200 ml)，再用含1%聚山梨酯80 的0.1%無菌蛋白胨水溶液分次沖洗(每膜不少于800 ml)，注入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100 ml，同法制備10 份。另取本品適量，置含玻璃珠滅菌容器內(nèi)加0.1%無菌蛋白胨水溶液混合均勻使成每1 ml 中含0.2 g 的溶液，取25 ml 置500 ml 改良馬丁培養(yǎng)基中。以大腸埃希菌為陽性對照菌［3，4］，依法檢查(《中國藥典》2010 年版二部附錄ⅪH)，應(yīng)符合規(guī)定。

3 討論

3.1 真菌檢查也可以與細(xì)菌檢查相同，采用薄膜過濾法進(jìn)行，考慮到試驗(yàn)的便捷性，最后采用直接接種法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2 薄膜過濾法進(jìn)行細(xì)菌檢查時(shí)，先用無菌十四烷酸異丙酯分次沖洗，再用含1%聚山梨酯80 的0.1%無菌蛋白胨水溶液分次沖洗，可以有效消除鹽酸環(huán)丙沙星的抑菌性，同時(shí)防止基質(zhì)析出，堵塞濾膜。

3.3 試驗(yàn)結(jié)果顯示，供試組與陽性對照組中試驗(yàn)菌細(xì)菌均在1 d 內(nèi)生長良好，試驗(yàn)菌真菌均在2 d 內(nèi)生長良好，符合驗(yàn)證要求，表明在上述試驗(yàn)條件下，可消除樣品的抑菌活性，對微生物的生長無影響。

采用本方法進(jìn)行鹽酸環(huán)丙沙星乳膏無菌檢查，消除了抑菌作用，符合《中國藥典》相關(guān)規(guī)定，在一定程度上保證了無菌檢查方法的科學(xué)有效，為鹽酸環(huán)丙沙星乳膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了有效保證。

1 馬仕洪，劉鵬，戴翚，等. 加替沙星無菌檢查方法的建立與標(biāo)準(zhǔn)操作探討［J］. 藥物分析雜志，2007，27(6):877

2 麻明臣，邱海濱，李志新，等. 建立乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的無菌檢查方法［J］. 中國藥事，2008，22(3):251

3 劉廣楨，林林，徐曉潔，等. 乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液無菌檢查法的驗(yàn)證［J］. 中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2008，9(1):38