盧圣霞， 劉元濤， 孔 峰， 杜月娟， 劉 曄， 傅余芹△

(山東大學(xué)第二醫(yī)院1腎臟內(nèi)科，2內(nèi)分泌科，3中心實(shí)驗(yàn)室 山東 濟(jì)南250033;4濟(jì)南市中心醫(yī)院腎臟內(nèi)科，山東 濟(jì)南250013)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一，以腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過(guò)度沉積為其顯著的病理特點(diǎn)，成為導(dǎo)致終末期腎病最主要的原因［1-2］。高血糖是導(dǎo)致DN 發(fā)病的一個(gè)主要因素，它通過(guò)激活多條信號(hào)通路，上調(diào)纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)及I型膠原(collagen type I，Col I)的表達(dá)，最終導(dǎo)致ECM積聚［3-4］。Caveolae 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種富含膽固醇(cholesterol，Chol)及磷脂的胞膜小凹結(jié)構(gòu)，caveolin是其標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上。研究表明，caveolae 為多種信號(hào)分子提供了一個(gè)聚集的場(chǎng)所，對(duì)于細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種功能具有重要調(diào)控作用［5-6］。腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cells，MCs)是一種類平滑肌樣細(xì)胞，其細(xì)胞膜含有caveolae［6］。既往研究發(fā)現(xiàn)，caveolae 在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ECM 分泌過(guò)程中具有重要作用［7］，而高糖環(huán)境下caveolae 在腎小球系膜細(xì)胞ECM 合成中的作用目前尚不明確。本研究旨在探討caveolae 在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞ECM 合成中的作用與機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠腎小球系膜細(xì)胞(由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院易凡教授惠贈(zèng));DMEM 培養(yǎng)基和新生胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購(gòu)自Gibco;小凹蛋白1(caveolin-1，Cav-1)抗體購(gòu)自BD;磷酸化的小凹蛋白1(phosphorylated caveolin-1 on tyrosine 14，p-Cav-1-Y14)抗體購(gòu)自CST;Col I 抗體購(gòu)自Abcam;β-actin 抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔Ⅱ抗和鼠Ⅱ抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司;FN ELISA 試劑盒購(gòu)自RD。Real-time PCR Ultra SYBR mixture 試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程總公司;RIPA、PMSF 和BCA 試劑盒均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

2 方法

2.1 大鼠腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng) MCs 以(0.5 ～1)×106接種于DMEM 完全培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺)，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 ～3 d 換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至90% 培養(yǎng)皿時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2.2 細(xì)胞分組及處理 培養(yǎng)細(xì)胞待其貼壁融合70% ～80%后用無(wú)血清低糖DMEM 培養(yǎng)基同步化24 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行如下分組及處理:(1)正常糖(normal glucose，NG)組(5.5 mmol/L 葡萄糖+24.5 mmol/L 甘露醇);(2)高糖(high glucose，HG)HG 組(30 mmol/L 葡萄糖);各組繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞0、12、24 和48 h。為觀察高糖誘導(dǎo)Cav-1 磷酸化的劑量效應(yīng)，不同濃度的葡萄糖(5.5、16.7 和30.0 mmol/L)分別處理細(xì)胞1 h，各組滲透壓均用甘露醇調(diào)整至30.0 mmol/L 以避免滲透壓不同對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的干擾(5.5 mmol/L 葡萄糖+24.5 mmol/L 甘露醇;16.7 mmol/L 葡萄糖+13.3 mmol/L 甘露醇)。為觀察高糖誘導(dǎo)Cav-1 磷酸化的時(shí)間效應(yīng)，選取作用效果最明顯的30.0 mmol/L 葡萄糖短時(shí)處理細(xì)胞0～4 h。同步化的細(xì)胞經(jīng)甲基-β-環(huán)糊精(methyl-βcyclodextrin，β-MCD;5 mmol/L)預(yù)處理1 h 后再分為2 組:β-MCD+HG 組(5 mmol/L β-MCD + 30 mmol/L 葡萄糖);β-MCD+HG+Chol 組(5 mmol/L β-MCD+ 30 mmol/L 葡萄糖+ 15 mg /L Chol)，各組繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞1、12、24 和48 h，按照各處理組指定時(shí)間收集細(xì)胞及上清，進(jìn)行分析。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 以TRIzol 抽提處理后的細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green 嵌合熒光進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系25 μL，上、下游引物均由大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)設(shè)計(jì)合成(表1)，反應(yīng)條件如下:預(yù)變性:95 ℃，30 s;95 ℃，5 s;55℃～60 ℃，34 s;同時(shí)獲取熒光，共40 個(gè)循環(huán)，每組重復(fù)6 次，反應(yīng)結(jié)束后行產(chǎn)物的熔解曲線分析，以GAPDH 為內(nèi)參照進(jìn)行結(jié)果分析。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 的引物序列Table 1. Real-time PCR primer sequences

2.4 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中FN 蛋白含量 取不同處理因素作用0、12、24 和48 h 的細(xì)胞上清液，6 000 r/min 4 ℃離心10 min，收集上清，每組重復(fù)3次，后續(xù)操作按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零，直接測(cè)定其吸光度(A)，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線公式換算成各蛋白的濃度值。

2.5 Western blotting 細(xì)胞處理不同時(shí)點(diǎn)后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS 洗3 遍，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞蛋白。BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。等量細(xì)胞蛋白(60 μg)加5 ×loading buffer 煮沸變性10 min，10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至NC 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，Ⅰ抗［Cav-1(1 ∶2 000);p-Cav-1-Y14(1∶1 000);Col I(1∶1 000);β-actin (1∶1 000)］4 ℃孵育過(guò)夜，NC 膜用TBST 緩沖液洗3 遍后，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h 后顯影。免疫復(fù)合物用ECL 方法檢測(cè)，電泳條帶用ImageJ 軟件分析灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，組間比較及顯著性檢驗(yàn)采用One-way ANOVA 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高糖對(duì)系膜細(xì)胞FN 和Col I 蛋白表達(dá)的影響

與NG 組相比，高糖培養(yǎng)24 h 細(xì)胞FN 濃度顯著增加(P ＜0.05)，48 h 達(dá)到高峰，見(jiàn)圖1。與HG 0 h組相比，高糖培養(yǎng)12 h 細(xì)胞Col I 蛋白表達(dá)明顯增多(P ＜0.05)，48 h 達(dá)到高峰，見(jiàn)圖2。

Figure 1. Quantitative analysis of the FN level induced by high glucose (30 mmol/L). Mean ±SD. n =3. * P ＜0.05 vs NG group.圖1 高糖(30 mmol/L)對(duì)系膜細(xì)胞FN 蛋白水平的定量分析

Figure 2. The effect of high glucose (30 mmol/L)on expression of Cav-1 and Col I. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05 vs HG 0 h group.圖2 高糖(30 mmol/L)對(duì)系膜細(xì)胞Col I 和Cav-1 蛋白表達(dá)的影響

2 高糖對(duì)系膜細(xì)胞Cav-1 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響

高糖處理系膜細(xì)胞，各時(shí)點(diǎn)Cav-1 mRNA 及蛋白表達(dá)量較HG 0 h 組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＞0.05)，見(jiàn)圖2、3。

Figure 3. The effect of high glucose (30 mmol/L)on Cav-1 mRNA expression.Mean±SD.n=3.圖3 高糖(30 mmol/L)對(duì)系膜細(xì)胞Cav-1 mRNA 表達(dá)的影響

3 高糖對(duì)腎小球系膜細(xì)胞Cav-1 磷酸化水平的影響

以p-Cav-1-Y14 與Cav-1 灰度比值作為Cav-1 磷酸化水平的指標(biāo)進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示:不同濃度(5.5、16.7 和30 mmol/L)葡萄糖處理MCs，Cav-1 磷酸化水平呈現(xiàn)濃度依賴性升高(P ＜0.01)，見(jiàn)圖4;30 mmol/L 高糖處理后，Cav-1 磷酸化水平于0.5 h即可出現(xiàn)升高，1 h 達(dá)到高峰，之后磷酸化水平逐漸下降(P ＜0.01)，見(jiàn)圖5。

4 甲基-β-環(huán)糊精及膽固醇對(duì)腎小球系膜細(xì)胞Cav-1 磷酸化水平的影響

與單純HG(30 mmol/L)組相比，β-MCD(預(yù)處理1 h)+HG(30 mmol/L，1 h)組Cav-1 磷酸化水平明顯下降(P ＜0.01);而β-MCD + HG + Chol(15 mg/L)組Cav-1 磷酸化水平較β-MCD +HG 組顯著升高(P ＜0.01)，見(jiàn)圖6。

Figure 4. Phosphorylation of Cav-1 induced by high glucose at different concentrations.Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs NG (5.5 mmol/L)group;##P ＜0.01 vs HG (16.7 mmol/L)group.圖4 高糖誘導(dǎo)Cav-1 磷酸化的劑量效應(yīng)

Figure 5. Phosphorylation of Cav-1 induced by high glucose(30 mmol/L)at different time points. Mean ± SD. n =3.＊＊P ＜0.01 vs HG 0 h group.圖5 高糖(30 mmol/L)誘導(dǎo)Cav-1 磷酸化的時(shí)間效應(yīng)

Figure 6. Effects of β-MCD(5 mmol/L)and cholesterol(15 mg/L)on phosphorylation of Cav-1.Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs NG group;##P ＜0.01 vs HG group;△△P ＜0.01 vs HG+β-MCD group.圖6 甲基-β-環(huán)糊精(5 mmol/L)及膽固醇(15 mg/L)對(duì)系膜細(xì)胞Cav-1 磷酸化的影響

5 甲基-β-MCD 及膽固醇對(duì)細(xì)胞FN 及Col-1 蛋白表達(dá)的影響

與單純HG 組相比，HG +β-MCD 組各時(shí)點(diǎn)FN的濃度均顯著降低(均P ＜0.05)，見(jiàn)圖7;與HG+β-MCD 組相比，HG+β-MCD+ Chol 組各時(shí)點(diǎn)FN 濃度均明顯升高(均P ＜0.05)，見(jiàn)圖7。各時(shí)點(diǎn)Col-1 蛋白表達(dá)量在HG、HG + β-MCD 及HG + β-MCD +Chol 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＞0.05)，圖8 為各組處理細(xì)胞48 h 后的結(jié)果。

討 論

Caveolae 是具有燒瓶底型凹陷形態(tài)的特殊脂筏結(jié)構(gòu)，廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上［6］。在腎臟，caveolae 主要存在于腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞及系膜細(xì)胞［5-6］。Cav-1 是caveolae 的標(biāo)志性蛋白，對(duì)維持caveolae 結(jié)構(gòu)和功能的完整起關(guān)鍵作用［8］。目前已知，caveolae 參與細(xì)胞分化、增殖、腫瘤、炎癥、衰老等多種病理生理過(guò)程，對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有重要的意義［9］。既往研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞Cav-1 表達(dá)明顯升高，而Cav-1 表達(dá)升高可抑制eNOS 活性，使NO 合成減少［10］，這可能是糖尿病腎病的重要發(fā)病機(jī)制之一。至于糖尿病狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞Cav-1 表達(dá)的變化及其在糖尿病腎病中的病理意義目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞FN 和Col I mRNA 及蛋白水平明顯升高，這與既往的研究結(jié)果一致［11］。為探討caveolae在高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞ECM合成中的作用，我們觀察了高糖對(duì)Cav-1 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示高糖對(duì)Cav-1 的mRNA 及蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。

Figure 8. The effect of β-MCD (5 mmol/L)and cholesterol (15 mg/L)on Col I expression. Mean ±SD. n =3. * P ＜0.05 vs NG group.圖8 甲基-β-環(huán)糊精(5 mmol/L)及膽固醇(15 mg/L)對(duì)系膜細(xì)胞Col-1 表達(dá)的影響

最初，Cav-1 是以其酪氨酸磷酸化的形式，作為Src 激酶的磷酸化底物被首次發(fā)現(xiàn)［12］。業(yè)已證實(shí)，位于Cav-1 的N 末端酪氨酸14 位點(diǎn)是其主要磷酸化位點(diǎn)［13］。除Src 之外，多種細(xì)胞因子(如血小板衍生因子、上皮生長(zhǎng)因子、胰島素等)也能夠引起該位點(diǎn)的磷酸化。p-Cav-1-Y14 被認(rèn)為是Cav-1 的活化形式，可與多種信號(hào)蛋白交聯(lián)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖狀態(tài)下Cav-1 蛋白表達(dá)雖無(wú)變化，但其磷酸化水平顯著升高，且與FN 表達(dá)密切相關(guān)。

Caveolae 結(jié)構(gòu)中富含膽固醇，而膽固醇對(duì)維持caveolae 結(jié)構(gòu)和功能是必需的。β-MCD 是一種細(xì)胞外膽固醇受體，對(duì)膽固醇有很高的親和力，可以去除胞膜中的膽固醇，特異性干擾caveolae 形成而不對(duì)胞膜的完整性造成影響［16-17］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β-MCD 預(yù)處理可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的Cav-1 磷酸化，同時(shí)導(dǎo)致FN 合成減少，但對(duì)高糖誘導(dǎo)的Col I 表達(dá)無(wú)顯著影響。以上結(jié)果提示，高糖誘導(dǎo)的Cav-1 磷酸化有賴于caveolae 結(jié)構(gòu)的完整，而磷酸化的Cav-1 可能介導(dǎo)了高糖誘導(dǎo)的FN 合成，但對(duì)高糖誘導(dǎo)的Col I 合成無(wú)介導(dǎo)作用。以上結(jié)果提示高糖通過(guò)多種信號(hào)途徑對(duì)不同細(xì)胞外基質(zhì)的合成進(jìn)行調(diào)控。

總之，本研究結(jié)果提示caveolae 及其結(jié)構(gòu)蛋白Cav-1 在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞FN 的合成過(guò)程中具有重要調(diào)節(jié)作用。關(guān)于高糖狀態(tài)下Cav-1 磷酸化的發(fā)生機(jī)制以及磷酸化的Cav-1 如何調(diào)節(jié)FN 合成尚待進(jìn)一步研究。

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