李玉瓏，農(nóng)小獻(xiàn)，李虹輝，王貝貝，劉希良，褚武英，張建社*，李琦華*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，中國昆明 650201;2.長沙大學(xué)生物工程與環(huán)境科學(xué)系，中國長沙 410003;3.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，中國南寧 530004)

生肌調(diào)節(jié)因子對成肌細(xì)胞的發(fā)育和分化起決定作用.自從1987年Devis 克隆得到第一個生肌調(diào)節(jié)因子MyoD 基因以來，對生肌調(diào)節(jié)因子的研究越來越受到科研工作者的重視，迄今已經(jīng)克隆獲得多種脊椎動物的MyoD 基因［1］.MyoD 基因是生肌調(diào)節(jié)因子家族的主要成員之一，該家族基因具有一個保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)(bHLH，b basic helix-Loop-helix).b 區(qū)(堿性區(qū))是MyoD 與DNA 結(jié)合的部位，其中含有一個稱為生肌識別結(jié)構(gòu)(MRM)的保守序列.是MyoD 識別、結(jié)合肌肉專一基因的關(guān)鍵［2］.HLH 與蛋白聚合有關(guān)，MyoD 只有與自身或與其他b-HLH 因子形成二聚體后才能與特定的肌肉基因結(jié)合.MyoD 基因是脊椎動物胚胎期肌肉發(fā)育的主導(dǎo)調(diào)控基因之一，對骨骼肌的形成和分化起主要作用，可通過多個途徑激活肌肉基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化［3］.

胚胎發(fā)育過程中大量基因都是在特定的時間、特定的過程中起作用.整體胚胎原位雜交能夠直觀地觀察基因在整體中的時空表達(dá)分布.MyoD 時空表達(dá)規(guī)律與肌肉的分化、形成密切相關(guān).在發(fā)育過程中MyoD 具有特定的表達(dá)模式、存在時間、位置和不同表型，且存在種屬差異［4］.小鼠MyoD 首先在新生成的頭部體節(jié)短暫表達(dá)，隨后在生肌節(jié)強(qiáng)烈表達(dá).爪蟾MyoD 表達(dá)先于體節(jié)形成，而海膽MyoD 在原腸形成后才表達(dá)［5］.目前對MyoD 激活表達(dá)的機(jī)理所知甚少，決定MyoD 基因是否激活和表達(dá)的因素也不清楚，可能由發(fā)育、細(xì)胞生長狀態(tài)及其他細(xì)胞因子等復(fù)雜因素共同調(diào)節(jié).

鱖魚(Siniperca chuatsi)屬鱸形目，鮨科，鱖屬.鱖魚是原產(chǎn)于我國各主要江河湖泊的名貴食用魚.鱖魚味道鮮美，肉質(zhì)細(xì)嫩，營養(yǎng)價值高，深受廣大消費(fèi)者歡迎［6］.上世紀(jì)80年代鱖魚人工繁殖成功并進(jìn)行大規(guī)模推廣養(yǎng)殖，使之成為我國主要名貴養(yǎng)殖魚類之一.目前我國鱖魚養(yǎng)殖年產(chǎn)量超過20 萬噸，其產(chǎn)值每年在100億人民幣以上，而且近幾年其價格穩(wěn)中有升，人工養(yǎng)殖獲經(jīng)濟(jì)效益較大，現(xiàn)已成為水產(chǎn)品市場中重要中高檔產(chǎn)品［7］.近年來，本課題組圍繞鱖魚優(yōu)良肉質(zhì)性狀的理化特征、遺傳控制的基因組學(xué)以及肌肉相關(guān)功能基因的克隆和表達(dá)分析進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究［8］.這些前期工作為研究鱖魚MyoD 激活表達(dá)的機(jī)理研究奠定基礎(chǔ).本文對鱖魚早期發(fā)育過程中MyoD 時空表達(dá)規(guī)律研究不僅有助于我們更深一步研究魚類MyoD 激活表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，而且將為我國魚類肉質(zhì)品質(zhì)改良和促進(jìn)水產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)、高效和健康發(fā)展提供重要的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮活鱖魚購于長沙西長街特種水產(chǎn)品市場，解剖獲取魚背部新鮮肌肉組織用于MyoD 基因克隆.由湖南水產(chǎn)科學(xué)研究所提供的成熟雌、雄鱖魚，人工受精后收集發(fā)育正常的鱖魚胚胎用于MyoD 基因表達(dá)分析.取相應(yīng)時期的胚胎于無菌的EP 管中，放入40 g/L 的胚胎固定液中固定過夜，24 h 后用溶液PBST 沖洗3 次，再分別用體積分?jǐn)?shù)為25%、50%和75%PBST 的甲醇溶液脫水，100%的甲醇溶液脫水2 次，每次10 min，最后將處理的胚胎置于100%的甲醇中，放入－20 ℃冰箱中保存.

1.2 RNA 提取和cDNA 單鏈的合成

根據(jù)Trizol Reagent(Invitrogen)試劑盒使用說明，以鱖魚背部肌肉樣品和不同發(fā)育時期的樣品提取總RNA并檢測RNA 的質(zhì)量，cDNA 單鏈的合成按Fermentas pureExtreme 公司cDNA 合成試劑盒按產(chǎn)品說明書進(jìn)行.

1.3 引物設(shè)計及PCR 產(chǎn)物的擴(kuò)增、轉(zhuǎn)化和測序

根據(jù)NCBI 上已登錄的石斑魚、金頭鯛、斑馬魚等的MyoD 序列，利用Primer premier 5.0 設(shè)計3 對引物來擴(kuò)增MyoD 基因編碼區(qū)序列(見表1)，引物由上海博尚生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

表1 用于克隆MyoD 及整體原位雜交引物Tab.1 Primers used for MyoD gene isolation and whole-mount in situ hybridization

以鱖魚cDNA 第一鏈為模板，用M1 和M2 引物對鱖魚MyoD 基因的編碼區(qū)進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增.PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共進(jìn)行30 個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min.反應(yīng)完后，用1%瓊脂糖電泳測定擴(kuò)增產(chǎn)物濃度和純度，并切取含有目的片段的凝膠，割膠回收純化PCR 產(chǎn)物，純化PCR 產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy 載體上.取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，涂在含氨芐青霉素的LA 平板上，挑取白色單菌斑培養(yǎng)，確定陽性克隆.將篩選出的陽性克隆抽提質(zhì)粒，進(jìn)行序列測定.

1.4 氨基酸序列比對和蛋白質(zhì)功能區(qū)分析

序列拼接后，采用NCBI 中的BLAST 程序進(jìn)行目的基因序列同源性比對和相似性搜索，序列分析使用DNAStar 分析軟件，Edit Seq 用于ORF 分析以及蛋白序列的推測.蛋白質(zhì)功能區(qū)由PROSITE tools(http://www.expasy.org/prosite)預(yù)測.

1.5 基因表達(dá)分析

將克隆得到的MyoD 基因的陽性克隆菌液，按照OMERA 質(zhì)粒提取試劑盒的說明提取質(zhì)粒，根據(jù)測序的結(jié)果用NEB Cut 尋找質(zhì)粒上、片段外唯一的酶切位點(diǎn)，用ApaI 限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒線性化.根據(jù)線性化的酶切位點(diǎn)ApaI 確定逆轉(zhuǎn)錄的啟動子為Sp6.20 μL 逆轉(zhuǎn)錄體系如下:3 μL DNA，5 μL ddH2O，2 μL 6.5×NTP，2 μL DTT，4 μL 5×Buffer，2 μL Dig-UTP，1 μL RNase Inhibitor，1 μL Sp6 RNA polyrnerase.將逆轉(zhuǎn)錄合成的探針保存于－80 ℃?zhèn)溆?

取出－20 ℃冰箱中保存在100%甲醇中的胚胎材料于1.5 mL 的離心管雜交前處理后，加入400 μL 雜交液，65 ℃水浴預(yù)雜交3 h.將合成的探針用雜交液按1∶150 稀釋并65 ℃預(yù)熱.加入稀釋好的探針70 μL，65 ℃水浴過夜.回收探針，進(jìn)行雜交后處理，然后進(jìn)行沖洗和顯色，染上清晰顏色以后，用PBST 清洗掉多余顯色液，再用40 g/LPFA/PBS 室溫下固定1 h 以上或4 ℃固定過夜.用PBST 清洗掉多余的固定液.將胚胎保存在體積比為1∶1 的甘油/PBST 混合液中.最后用體視鏡觀察并拍照.

2 結(jié)果與分析

2.1 MyoD cDNA 序列及其推導(dǎo)氨基酸序列分析

通過對鱖魚MyoD cDNA 序列的克隆，得到了鱖魚MyoD 基因的cDNA 序列(圖1)，序列已提交Genebank，登錄號:JN561167.克隆得鱖魚MyoD 基因cDNA813bp，編碼270 個氨基酸，推導(dǎo)的氨基酸序列相對分子質(zhì)量為19 954.86，等電點(diǎn)7.71，pH7 時帶電量3.00.氨基酸序列含有1 個bHLH 結(jié)構(gòu)(圖2).

圖1 MyoD cDNA 序列Fig.1 The sequence of MyoD cDNA

圖2 各物種MyoD 氨基酸部分序列結(jié)構(gòu)分析及其同源性比較Fig.2 Protein sequence comparison of MyoD from 14 vertebrates

2.2 鱖魚MyoD 與其他物種的相應(yīng)氨基酸同源性比較

用MEGA5.05 軟件對不同物種MyoD 基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)鱖魚(Siniperca chuatsi，AEM98184)與石斑魚(Epinephelus coioides，ADJ95348)的同源性較高，與綠變色蜥(Anolis carolinensis，XP_003214790)、綠頭鴨(Anas platyrhynchos，ACO57137)、鼠(Mus musculus，EDL22927)的同源性較低，與人(Homo sapiens，CAA40000)的同源性最低.不同物種的MyoD 氨基酸序列差異大.例如魚類與兩棲類、爬行類、鳥類、哺乳類相比缺少了N 端的10 個氨基酸殘基;雖然不同物種間MyoD 蛋白質(zhì)序列差異大，但也存在一些共同點(diǎn).例如圖2所示存在3 個保守區(qū)，第一個保守區(qū)在bHLH 結(jié)構(gòu)處.

2.3 鱖魚胚胎時期MyoD 的表達(dá)情況

由圖3 可見，鱖魚MyoD 在胚胎剛受精、囊胚期和原腸期均無表達(dá).MyoD 最早在肌節(jié)早期被檢測到信號.當(dāng)9 體節(jié)時期，MyoD 的表達(dá)量明顯增多.伴隨著鱖魚體節(jié)從頭部往尾部表達(dá).體節(jié)期，MyoD 在中后部表達(dá).尾芽期MyoD 的表達(dá)量達(dá)到最大值.然而，尾芽期過后，MyoD 的表達(dá)量急劇減少，尤其是頭端，但是尾部仍然有強(qiáng)烈的信號.血流期在鱖魚尾部檢測到微弱信號.孵出期在魚眼的后方和胸部檢測到強(qiáng)信號，而身體其他部位檢測不到信號.仔魚期沒有檢測到MyoD 表達(dá)的信號.

圖3 鱖魚胚胎MyoD 基因的整體原位雜交Fig.3 Temporal expression of MyoD during embryonic development with whole-mount in situ 509 hybridization

3 討論

MyoD 基因作為肌肉轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，可通過多個途徑激活肌肉基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化，是骨骼肌細(xì)胞分化的決定性基因，其表達(dá)對維持肌分化有重要作用［9-10］.

各物種MyoD 的氨基酸殘基數(shù)量不盡相同，例如石斑魚含有269 個氨基酸殘基，大西洋比目魚含有296個氨基酸殘基;非洲爪蟾含有288 個氨基酸殘基;綠變色蜥含有305 個氨基酸殘基;鳥類的綠頭鴨和火雞都含有297 個氨基酸殘基;亞洲水牛和人類都含有319 個氨基酸殘基.隨著物種由低等向高等進(jìn)化，MyoD 氨基酸殘基的數(shù)目有增加的趨勢，從石斑魚的269 個增加到牛和人的319 個.即使同屬于魚類，不同魚的肽鏈長度也有差異［11-12］.通過PROSITE tools 在線工具對鱖魚MyoD 推導(dǎo)的蛋白質(zhì)功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，鱖魚MyoD 的蛋白質(zhì)有一個含有bHLH 結(jié)構(gòu)，且bHLH 結(jié)構(gòu)保守性高.高度保守的bHLH 結(jié)構(gòu)與MyoD 的生物學(xué)功能相關(guān).堿性區(qū)域是與許多肌肉特異基因DNA(CK、myogenin 等)的啟動子或增強(qiáng)子結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)域［13-14］，例如當(dāng)MyoD 的蛋白質(zhì)與MyoG 等靶基因的E-box(CANNTG)結(jié)合后能夠促進(jìn)靶基因的特異性轉(zhuǎn)錄［15-16］.Davis等人研究發(fā)現(xiàn)堿性區(qū)域的幾個氨基酸(Arg、Ala、Thr、Lys)是激活肌肉基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵，當(dāng)用其他bHLH 蛋白相應(yīng)位置的氨基酸取代這些氨基酸，MyoD 對其家族的肌肉基因轉(zhuǎn)錄的作用消失，但不會影響其與DNA結(jié)合［17］.

本文運(yùn)用整體胚胎原位雜交法對鱖魚MyoD 基因在胚胎發(fā)育中的表達(dá)情況進(jìn)行研究.結(jié)果表明，鱖魚MyoD 基因在肌節(jié)早期或原腸晚期表達(dá)，且先于體節(jié)形成.在尾芽期(約24 體節(jié))之后，MyoD 在近頭端先形成的體節(jié)中的表達(dá)減少，但尾部的信號依然強(qiáng).在剛孵出的鱖魚眼睛后方和胸部腹側(cè)檢測到強(qiáng)烈的MyoD 信號.Cheng-Yung Lin 等人用基因敲除技術(shù)敲除斑馬魚MyoD 基因后，發(fā)現(xiàn)斑馬魚的上直肌、內(nèi)直肌、下直肌、外直肌和咽喉腹側(cè)的肌肉都不能形成［18］;鱖魚眼睛后方的信號是否是MyoD 在調(diào)節(jié)咽喉腹側(cè)的肌肉形成，以及MyoD 胸部腹側(cè)信號在調(diào)節(jié)哪些肌肉形成還有待進(jìn)一步研究.

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