袁海波　金晶　許春姣等

[摘要] 目的 檢測分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（SFRP1）在慢性牙周炎（CP）患者和牙周健康者的表達(dá)情況，探討SFRP1在CP的發(fā)生與發(fā)展過程中的作用。方法 選擇CP患者28例為試驗(yàn)組，按臨床附著喪失（CAL）程度分為輕、中、重度3組，另外選擇牙周健康者10例為對照組。收集兩組研究對象的齦溝液，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定齦溝液中SFRP1的質(zhì)量濃度。取試驗(yàn)組中22例CP患者的病變牙齦組織標(biāo)本，以及10例對照組的正常牙齦組織，進(jìn)行SFRP1免疫組織化學(xué)染色，觀察著色強(qiáng)度，分析SFRP1表達(dá)與不同程度CP的相關(guān)性。結(jié)果 1）試驗(yàn)組和對照組齦溝液中SFRP1的質(zhì)量濃度分別為（281.07±33.37）和（245.30±35.69）ng·L-1，試驗(yàn)組明顯高于對照組（P<0.05）；齦溝液內(nèi)SFRP1質(zhì)量濃度與CAL呈明顯正相關(guān)（r=0.651，P<0.001）。2）試驗(yàn)組SFRP1著色強(qiáng)度積分值（4.500±0.913）明顯高于對照組（2.800±1.135）（P<0.001）；試驗(yàn)組中，輕、中、重度CP組間的著色強(qiáng)度積分值無明顯差異（P>0.05）。結(jié)論 SFRP1在CP患者齦溝液及牙齦組織中的表達(dá)高于牙周健康者，SFRP1可能參與了CP的發(fā)生發(fā)展過程。

[關(guān)鍵詞] 慢性牙周炎； 齦溝液； 分泌型卷曲相關(guān)蛋白1

[中圖分類號] R 783.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.017

分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（secreted frizzled-related protein 1，SFRP1）是一種分泌型糖蛋白，是Wnt信號通路的重要拮抗劑。Wnt信號通路能影響人牙周膜成纖維細(xì)胞（periodontal ligament cells，PDLCs）的成骨分化調(diào)節(jié)骨生成和改建[1-2]，由此推測，SFRP1與慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）可能存在密切關(guān)系。本研究通過檢測CP患者齦溝液中SFRP1的水平及病變牙齦組織中SFRP1的表達(dá)，探討SFRP1在CP發(fā)生中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料與研究對象

SFRP1酶聯(lián)免疫分析試劑盒（R&D;公司，美國），SFRP1兔抗人、鼠多克隆抗體（Abcam公司，美國），通用型Streptavidin-HRP試劑盒、免疫組織化學(xué)DAB顯色劑（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

實(shí)驗(yàn)對象均取自2011年3—12月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院口腔科就診的患者，選擇CP患者28例為試驗(yàn)組，牙周健康者10例為對照組。CP患者按照臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL）分為3度：輕度CP患者9例，CAL為1～2 mm；中度CP患者10例，CAL為3～4 mm；重度CP患者9例，CAL≥5 mm。試驗(yàn)組與對照組年齡、性別均匹配。所有研究對象均了解本次研究目的，同意參與并配合試驗(yàn)，全身健康狀況良好，并符合以下要求：1）無糖尿病、心血管疾病、類風(fēng)濕疾病等全身系統(tǒng)性疾病，無其他系統(tǒng)感染；2）近半年內(nèi)未接受過牙周治療，近3個(gè)月內(nèi)未服用過抗生素、免疫抑制劑等藥物；3）女性未處于妊娠期、哺乳期、月經(jīng)期；4）咬合關(guān)系正常，無正畸治療史；5）無長期吸煙和酗酒史。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SFRP1在齦溝液中的質(zhì)量濃度 用專用標(biāo)準(zhǔn)濾紙條采集研究對象的齦溝液。采集部位為右下頜第一磨牙的齦溝或牙周袋內(nèi)6個(gè)位點(diǎn)（頰側(cè)遠(yuǎn)中、頰側(cè)中央、頰側(cè)近中，舌側(cè)遠(yuǎn)中、舌側(cè)中央、舌側(cè)近中）。檢測所有研究對象的牙周臨床指標(biāo)，包括牙周探診深度（probing depth，PD）、CAL、齦溝出血指數(shù)（bleeding index，BI）。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定齦溝液中SFRP1的質(zhì)量濃度。

1.2.2 SFRP1在牙周組織中的表達(dá) 手術(shù)中取22例CP患者的病變牙齦組織（輕、中、重度CP組分別為7、7、8例），10例對照組取手術(shù)切取的正常牙齦組織，固定包埋，切片，按照標(biāo)準(zhǔn)二步法進(jìn)行SFRP1免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察并照相。SFRP1在牙齦組織中的表達(dá)使用著色強(qiáng)度積分進(jìn)行評價(jià)[3]，以有棕黃色顆粒狀沉淀為陽性細(xì)胞，著色范圍以陽性細(xì)胞記分。陽性細(xì)胞所占比例≤1%記為0分，2%～

20%為1分，21%～50%為2分，≥50%為3分；著色程度依據(jù)深淺記分，無著色為0分，淺著色為1分，深著色為2分。上述兩項(xiàng)分值相加為著色強(qiáng)度積分值：≤1.9分為陰性（-），2～2.9分為弱陽性（+），3～3.9分為陽性（++），≥4分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用方差分析和LSD法分析各組齦溝液內(nèi)SFRP1的質(zhì)量濃度；Spearman相關(guān)分析法分析齦溝液內(nèi)SFRP1質(zhì)量濃度與CAL的關(guān)系；采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、方差分析、Tukey分析法分析各組牙齦組織中SFRP1的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 SFRP1在齦溝液中的質(zhì)量濃度

2.1.1 CP組與對照組齦溝液中SFRP1質(zhì)量濃度比較 經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，CP組齦溝液的量及SFRP1質(zhì)量濃度明顯高于對照組（P<0.05）（表1）。

2.1.2 各組齦溝液中SFRP1質(zhì)量濃度多重比較 輕、中、重度CP組的SFRP1質(zhì)量濃度分別為（250.42±19.48）、（285.70±21.29）、（306.57±32.50）ng·L-1。輕度CP組與對照組、中度CP組與重度CP組之間齦溝液中SFRP1的質(zhì)量濃度無明顯差異（P>0.05）；其余各組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，輕度CP組明顯低于中度和重度組，同時(shí)，中度和重度CP組明顯高于對照組，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.1.3 SFRP1質(zhì)量濃度與CAL的關(guān)系 經(jīng)Spearman相關(guān)分析，齦溝液內(nèi)SFRP1質(zhì)量濃度與CAL呈正相關(guān)關(guān)系（圖1，r=0.651，P<0.001）。

2.2 SFRP1在牙齦組織中的表達(dá)

2.2.1 SFRP1在各組中的表達(dá)形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 在正常的牙齦組織中，SFRP1的表達(dá)集中在上皮細(xì)胞，且棕黃色顆粒多沉積在細(xì)胞質(zhì)中（圖2A）；上皮下結(jié)締組織中少有染色，偶見成纖維細(xì)胞有陽性表達(dá)（圖

2B）。在慢性牙周炎牙齦中，SFRP1的表達(dá)較多，染色也較深，其上皮層的表達(dá)相對于對照組表達(dá)范圍更為廣泛，程度更深；上皮下結(jié)締組織中的表達(dá)對比明顯，SFRP1高表達(dá)于成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等（圖2C、D、E）。

2.2.2 SFRP1在牙齦組織中表達(dá)情況的分析 CP組和對照組的SFRP1表達(dá)強(qiáng)度見表2。在22例CP病例的牙齦組織中，SFRP1的表達(dá)陽性率為100%（22/22），強(qiáng)陽性表達(dá)率為77.27%（17/22）；10例對照組中，SFRP1的表達(dá)陽性率為80.00%（8/10），強(qiáng)陽性表達(dá)率為30.00%（3/10）；CP組和對照組的著色強(qiáng)度積分值分別為4.500±0.913和2.800±1.135，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

由表3可見：經(jīng)單因素方差分析，各組間整體比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.859，P=0.01），進(jìn)一步采用Tukey法進(jìn)行組間兩兩比較，發(fā)現(xiàn)除對照組與中度、重度CP之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P<0.05），其余組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

在慢性牙周炎的發(fā)病過程中，宿主對牙周致病微生物感染的初步應(yīng)答是激活免疫系統(tǒng)并引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，其后釋放一系列細(xì)胞因子和其他調(diào)節(jié)因子，炎癥反應(yīng)擴(kuò)散，從而波及到鄰近的結(jié)締組織和牙槽骨，導(dǎo)致牙周組織破壞。研究[4-5]表明，在疾病發(fā)展過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopro-teinases，MMPs）、白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等蛋白酶和炎癥介質(zhì)發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。Ma等[6]的研究顯示，在人軟骨細(xì)胞中，IL-1β通過一個(gè)負(fù)反饋回路影響Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）介導(dǎo)的MMPs的表達(dá)。Heo等[2]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典Wnt/β-catenin通路能影響人PDLCs的成骨分化，Wnt促進(jìn)劑氯化鋰能夠促進(jìn)人PDLCs的增殖分化。這些研究提示W(wǎng)nt信號通路可能參與了牙周炎的發(fā)展過程。

SFRP1是分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族中的一員，為Wnt信號通路的重要拮抗劑。本研究發(fā)現(xiàn)，SFRP1在慢性牙周炎的齦溝液中的質(zhì)量濃度以及在牙周組織中的表達(dá)均高于正常對照組，且有隨慢性牙周炎的嚴(yán)重程度增加而增加的趨勢，提示SFRP1與慢性牙周炎的發(fā)生進(jìn)展相關(guān)。

3.1 SFRP1在齦溝液中的質(zhì)量濃度

齦溝液是宿主內(nèi)外環(huán)境交匯的一個(gè)微環(huán)境，其成分發(fā)生變化能客觀地提示宿主的牙周狀態(tài)。Hanio-ka等[7]發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者齦溝液中PGE2、TNF-α、IL-l、IL-8等炎癥因子的濃度高于健康者，從而認(rèn)為這些炎癥因子可以作為牙周炎的監(jiān)控指標(biāo)。目前，對于SFRP1在牙周炎中的研究還較少。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SFRP1在CP患者齦溝液中的質(zhì)量濃度明顯高于正常對照組，提示SFRP1在炎癥狀態(tài)的牙周組織的質(zhì)量濃度較高。進(jìn)一步比較輕、中、重度CP及正常對照組，說明SFRP1的質(zhì)量濃度在正常牙周狀態(tài)或輕度CP進(jìn)展到中度或重度CP過程中發(fā)生了變化。本試驗(yàn)Spearman相關(guān)分析表明，齦溝液內(nèi)SFRP1質(zhì)量濃度與CAL呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示SFRP1的質(zhì)量濃度與慢性牙周炎牙槽骨破壞的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

3.2 SFRP1在牙齦組織中的表達(dá)

在牙周炎發(fā)展的過程中涉及到骨代謝的改變，而Wnt信號通路對骨代謝有著重要的影響。Wnt信號通路的激活能促進(jìn)成骨，在骨中高表達(dá)Wnt信號通路受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-5（low-density lipoprotein receptor-related protein-5，LRP-5）功能突變體轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏Wnt拮抗劑SFRP1分泌的小鼠，表現(xiàn)出骨礦化密度升高和抑制成骨細(xì)胞凋亡[1]；而LRP-5突變可導(dǎo)致骨礦化密度降低及骨折。Bodine等[8]證實(shí)，通過敲除小鼠Wnt信號拮抗劑SFRP1，能延長和增強(qiáng)小鼠骨小梁的生長，SFRP1的缺失能夠降低成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡，同時(shí)增強(qiáng)這些細(xì)胞的增殖和分化。

DKK1作為Wnt信號通路的抑制劑，在抑制骨質(zhì)形成的同時(shí)促進(jìn)骨質(zhì)破壞，在骨代謝中發(fā)揮著重要的作用[9]。Heo等[2]研究了氯化鋰和DKK1對PDLCs的作用，發(fā)現(xiàn)Wnt促進(jìn)劑氯化鋰能夠促進(jìn)PDLCs的增殖分化，而其拮抗劑DKK1的作用則相反。Li等[10]在研究牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)形成的牙周炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及骨細(xì)胞中SFRP1的表達(dá)明顯高于對照組；在實(shí)驗(yàn)組加入SFRP1抗體，另一組加入IgG抗體作為對照，可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組上皮萎縮和附著喪失顯著低于對照組，破骨細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核白細(xì)胞計(jì)數(shù)也低于對照組。由此可見，抑制SFRP1的表達(dá)能夠降低牙周組織的破壞，減少炎癥浸潤，降低破骨細(xì)胞數(shù)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，SFRP1在牙周炎及正常牙齦組織中均有表達(dá)，但在慢性牙周炎中的表達(dá)程度更高；從正常牙周狀態(tài)進(jìn)展到中度或重度慢性牙周炎過程中，牙齦組織中的SFRP1質(zhì)量濃度發(fā)生了變化，提示SFRP1參與了牙周炎的發(fā)展過程。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Bodine PV. Wnt signaling control of bone cell apoptosis[J]. Cell Res， 2008， 18（2）：248-253.

[2] Heo JS， Lee SY， Lee JC. Wnt/β-catenin signaling enhances osteoblastogenic differentiation from human periodontal ligament fibroblasts[J]. Mol Cells， 2010， 30（5）：449-454.

[3] 許良中， 楊文濤. 免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)[J]. 中國癌癥雜志， 1996， 6（4）：229-231.

[4] Schenkein HA. The pathogenesis of periodontal diseases [J]. J Periodontol， 1999， 70（4）：457-470.

[5] Bickel M， Axtelius B， Solioz C， et al. Cytokine gene expres-sion in chronic periodontitis[J]. J Clin Periodontol， 2001， 28（9）：840-847.

[6] Ma B， van Blitterswijk CA， Karperien M. A Wnt/β-catenin negative feedback loop inhibits interleukin-1-induced matrix metalloproteinase expression in human articular chondro-cytes[J]. Arthritis Rheum， 2012， 64（8）：2589-2600.

[7] Hanioka T， Takaya K， Matsumori Y， et al. Relationship of the substance P to indicators of host response in human gin-gival crevicular fluid[J]. J Clin Periodontol， 2000， 27（4）：262-266.

[8] Bodine PV， Zhao W， Kharode YP， et al. The Wnt antagonist secreted frizzled-related protein-1 is a negative regulator of trabecular bone formation in adult mice[J]. Mol Endocrinol， 2004， 18（5）：1222-1237.

[9] Qiang YW， Barlogie B， Rudikoff S， et al. Dkk1-induced inhibition of Wnt signaling in osteoblast differentiation is an underlying mechanism of bone loss in multiple myeloma[J]. Bone， 2008， 42（4）：669-680.

[10] Li CH， Amar S. Inhibition of SFRP1 reduces severity of periodontitis[J]. J Dent Res， 2007， 86（9）：873-877.

（本文編輯 吳愛華）