上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司(上海,201403)港龍生物技術(shù)(深圳)有限公司( 深圳， 518057)

人乳頭瘤病毒(HPV)是一類感染人類上皮細胞DNA病毒，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了130多種HPV型，有40多種可感生殖腔[1]。HPV可以引起人全身各部位的皮膚或者粘膜感染，導致多種上皮組織疾病，例如皮膚尋常疣，扁平疣，外生殖器的尖銳濕疣等。宮頸上皮組織長期感染的某些型別的HPV可能引起基因突變，導致宮頸上皮內(nèi)增生(CIN)[2-3]和宮頸癌[4-5]。沒有HPV感染不可能導致宮頸癌，而有HPV感染不一定會導致疾病和宮頸癌。根據(jù)其導致宮頸癌風險的高低將這些HPV分為高危型和低危型。高危型HPV可能引發(fā)婦女發(fā)生宮頸癌，主要包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82等型別；低危型HPV主要引起尖銳濕疣，包括HPV6、11、40、42、43、44、54、55、57、61、71、81、83等型別。

以抗體捕獲、核酸雜交和化學發(fā)光信號放大技術(shù)為基礎(chǔ)的第二代雜交捕獲法(HCII，美國Qiagen公司產(chǎn)品)是最早獲得美國FDA批準的臨床檢測HPV的方法[6]，能檢測13種高危型(包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68), 但是不具體分型。本研究采用的方法以PCR為基礎(chǔ)結(jié)合基因芯片(DNA微陣列)和反向點雜交技術(shù)對HPV進行高通量分型檢測?；蛐酒巧镄酒囊粋€種類，以陣列方式設(shè)定在平面基質(zhì)載體上形成能夠并行處理生物樣本中多個基因信息的微處理單元，它具有微型化和并行處理的特征，點陣排布點直徑在500 μm以內(nèi)，相鄰兩個點的中心點間距在1 000 μm以內(nèi)，點陣列用于檢測基因分子。利用微量點樣技術(shù)，將29種HPV型特異性探針點樣于基因芯片基質(zhì)上，制成基因芯片；經(jīng)過對樣本中的DNA進行PCR擴增、雜交和顯色，檢測生殖道脫落細胞(如宮頸口、尿道口等部位脫落細胞)中的人乳頭瘤病毒(HPV)DNA，可分型檢測29種HPV型(包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、26、40、42、43、44、53、54、55、57、66、67、69、73、82)。適用于臨床HPV感染患者及可疑HPV感染人群輔助診斷。利用基因芯片技術(shù)可以實現(xiàn)多指標大樣本平行進行高通量分析。本研究通過宮頸細胞樣本的檢測，與HCII試劑的檢測結(jié)果進行對比，對樣本感染HPV型別進行序列分析驗證，評價高通量人乳頭瘤病毒基因芯片的性能和臨床應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 檢測試劑 人乳頭瘤病毒分型檢測試劑盒(基因芯片法)由港龍生物技術(shù)深圳有限公司提供，HCII HPV檢測試劑購自Qiagen公司。

1.1.2 序列分析試劑 HotStar Taq Plus 購自Qiagen 公司，按照設(shè)計的型別特異性PCR引物擴增特定型別PCR產(chǎn)物，委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行序列分析服務(wù)。

1.1.3 儀器 ABI 9700 型PCR儀(Life Technologies)，人乳頭瘤病毒基因分型檢測閱讀系統(tǒng)(港龍生物技術(shù)(深圳)有限公司)。

1.2 樣本處理和HPV檢測

宮頸脫落細胞樣本2 mL，均分為2份，其中一份樣本按照港龍生物技術(shù)(深圳)有限公司人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒(基因芯片法)的方法進行處理。取出待處理標本，振蕩混勻；置離心機中以13 000 rpm離心5 min；棄上清，保留沉淀物。DNA提取時，準備2個離心管，分別加入陰性對照和陽性對照各5 μL。分別向上述對照品管及標本管加入50 μL HPV DNA提取液，振蕩混勻；然后沸水浴(或干浴)10 min。將樣本管置離心機中，13 000 rpm離心10 min，保留上清液(DNA樣品)。 提取的DNA樣品3 μL直接加樣進行PCR。另一份樣本按照HCII試劑的方法進行處理和檢測。

1.3 HPV型特異性序列分析方法

在HPV 的L1區(qū)設(shè)計特異性引物(序列見表1)，用特異性引物對29種HPV型別對相應(yīng)型別進行PCR擴增，用型特異性的正向或反向引物對PCR產(chǎn)物進行序列分析:對所有HPV分型檢測陽性樣本，包括HPV分型和HCII都為高危型陽性一致的樣本，用特異性引物擴增，用其產(chǎn)物和特異性PCR引物測序；對于HCII陽性，而HPV分型結(jié)果為陰性的樣本，分別用29種型別的特異性引物進行擴增，對產(chǎn)生的足夠PCR產(chǎn)物的樣本進行序列分析。

特異性引物擴增HPV DNA的反應(yīng)液20 μL體系的PCR反應(yīng)液組成為：1 PCR buffer Qiagen、0.4 mM 的dATP、dGTP、dCTP和dTTP(Takara)，正向引物和反向引物的濃度分別為2 pmol，0.1 μLHotStar Taq Plus (Qiagen), 樣本DNA加樣量為2 μL。特異性引物擴增程序為：95℃ 5 min，94℃ 30 s、 56℃ 30 s、72℃ 30 s共45個循環(huán)，然后72℃ 延伸反應(yīng)5 min。HPV型特異性序列分析方法的靈敏度最低可以達到10拷貝/ L樣本。

表1 29種型別HPV L1區(qū)特異性擴增引物序列Tab.1 The type-specific primers for PCR amplification of the segments in L1 gene among twenty-nine HPV genotypes

2 結(jié)果和討論

2.1 樣本的選擇

隨機選擇臨床門診生殖道HPV感染患者或可疑HPV感染病例，同時進行高通量HPV分型檢測，并與HCII檢測結(jié)果進行對比。本文試驗包括來自三家醫(yī)院的500例樣本，其中包括156例HCII陽性和344例HCII陰性。將HCII陽性樣本設(shè)定為有病組，陰性樣本設(shè)定為無病組，假設(shè)本方法的靈敏度為95%、特異度為95%，在允許誤差δ為5%，顯著性水平α為0.05時，具有統(tǒng)計學意義的最小樣本量分別為：

N有病組= (1.96)2×(0.95)×(1HPV0.95)/(0.05)2=72.99 ≈ 73

N無病組= (1.96)2×(0.95)×(1HPV0.95)/(0.05)2=72.99 ≈ 73

有病組現(xiàn)有156例，無病組344例，大于上述計算要求，樣本數(shù)符合具有統(tǒng)計學意義的最小樣本量要求。

2.2 與HCII對比評價和分析

2.2.1與對比試劑的靈敏度和特異性評價

500例樣本比較高通量HPV分型檢測與HCII的檢測結(jié)果，其中高通量HPV分型檢測結(jié)果是指與HCII相同的13種高危型HPV檢測結(jié)果(即高危型HPV的陰陽性判斷)，評價陽性符合率、陰性符合率及總符合率(表2)。156例HCII陽性樣本中，高通量HPV分型檢測陽性143例、陰性13例；高通量HPV分型檢測的陽性符合率為91.7%；344例HCII陰性樣本中，高通量HPV分型檢測結(jié)果有陰性329例、陽性15例，高通量HPV分型檢測的陽性符合率為90.5% (95%置信區(qū)間: 85.9% ～95.1%)、96.2% (95%置信區(qū)間: 94.2% ～98.2%)和94.4%(95%置信區(qū)間: 92.4% ～96.4%)，Kappa值為0.870(95%置信區(qū)間: 0.782～ 0.958)，說明高通量HPV分型檢測與HCII一致性較好。

表2 高通量HPV分型檢測與HCII產(chǎn)品符合率評價Tab.2 Comparison between the high-throughput HPV genotyping assay (HPG) and HCII for the detection of High-risk HPV genotypes

* 與HCII試劑檢測范圍相同的13種高危型HPV檢測結(jié)果kappa=0.870(95%置信區(qū)間：0.782-0.958)

按照13種高危型HPV為標準判斷陰性和陽性，與HCII檢測不一致的樣本共有28例(表2)。 在陽性一致的樣本中，高通量HPV分型檢測方法可以得出型別結(jié)果和多型感染。對所有陽性樣本和多型感染樣本進行序列分析，以DNA序列分析結(jié)果為標準評價高通量HPV分型檢測方法的真實靈敏度和特異性，表3列出兩種方法不一致樣本的序列分析結(jié)果(HPV分型檢測至少有一種13種高危型的結(jié)果，與HCII結(jié)果一致，序列分析結(jié)果未列出)。

HCII與高通量HPV分型檢測結(jié)果不一致樣本中，包含HCII陽性而高通量HPV分型檢測陰性13例，經(jīng)DNA測序驗證，其中有6例樣本含有低危型HPV感染、同時序列分析未檢出13種高危型；有1例樣本對13種高危型進行型特異性PCR及測序分析為陰性，說明上述7例均為不含13種高危型HPV感染(HCII假陽性)，有3例樣本經(jīng)測序分析確認分別為HPV16、HPV58和HPV68感染，說明HCII結(jié)果正確，高通量HPV分型檢測漏檢。另外，3例樣本DNA測序證實高通量HPV分型檢測分別未檢出HPV18、16、52高危型。以序列分析結(jié)果判斷，HCII陽性樣本中有6例含有13種高危型HPV(真陽性)，有7例不含13種高危型HPV(假陽性)，造成假陽性的樣本主要包含HPV66(3例)、HPV6(2例)和HPV53(1例)。

表3 HCII與高通量HPV分型檢測不一致樣本序列分析Tab.3 The sequences analysis of the discordant samples between HCII and HPG

注： 序列分析結(jié)果13種高危型HPV用黑體字表示

5例HCII陰性而高通量HPV分型檢測陽性樣本中，10例樣本經(jīng)DNA測序分析證實其中分別含有相對應(yīng)高危型存在，說明高通量HPV分型檢測結(jié)果正確，HCII漏檢(假陰性)；另有5例樣本高通量HPV分型檢測均檢出高危型，但測序未能確認，判斷為高通量HPV分型檢測假陽性。以序列分析結(jié)果判斷，這15例HCII樣本有5例為真陰性，10例為假陰性。

序列分析結(jié)果與高通量HPV分型檢測方法和HCII對13種高危型HPV的檢測結(jié)果對比(表4)，以DNA測序分析結(jié)果判斷，500例樣本中，13種高危型陽性樣本共有159例、13種高危型陰性341例。以序列分析結(jié)果評價兩種方法的靈敏度和特異性(表5)，高通量HPV分型檢測的靈敏度和特異度分別達到96.2%(95%置信區(qū)間：93.3%～99.2%)和98.5%(95%置信區(qū)間：97.3%～99.8%)，HCII的靈敏度和特異度分別為93.7%(95%置信區(qū)間：89.9%～97.5%)和97.4%(95%置信區(qū)間：96.4%～99.5%)，說明高通量HPV分型檢測產(chǎn)品對13種高危型HPV DNA檢測的準確性很高，高通量HPV分型檢測的靈敏度和特異度略高于HCII 。

表4 13種高危型的序列分析結(jié)果比較Tab.4 Comparison of the sequence analysis results with HPG and HCII

*與HCII試劑檢測范圍相同的13種高危型HPV檢測結(jié)果

表5 檢測的靈敏度和特異性比較Tab.5 Comparison of the sensitivity and specificity between HPG and HCII

注：括號內(nèi)數(shù)字表示95%置信區(qū)間

2.3 高通量HPV分型檢測分型準確率評價

以DNA測序結(jié)果為評價標準，評價本產(chǎn)品分型準確率。比較高通量HPV分型檢測檢測陽性樣本的測序結(jié)果，對測序確認為多型感染的樣本，至少有2個型與高通量HPV分型檢測結(jié)果符合的判斷為分型準確。如高通量HPV分型檢測多個型別，但是DNA測序驗證僅證實其中某一型，則判斷為分型不準確。如樣本DNA測序結(jié)果為陰性則不計入分型準確率統(tǒng)計。

累計有197例樣本成功測序：其中分型準確185例，包括138例單型感染和47例多重感染；分型不準確樣本數(shù)為12例(表6)。以序列分析結(jié)果評價高通量HPV分析檢測方法的分型準確率為93.9%(185/(197)。

表6 分型不準確的樣本序列分析結(jié)果Tab.6 Comparison of the discordant samples between HPG and sequence analysis

注：(-)表示HPV陰性

2.4 HPV型別分布

根據(jù)DNA測序結(jié)果，29種HPV型在HPV陽性樣本中的分布(表7)。高通量HPV分型檢測優(yōu)異的分析性能，能夠檢測29種型別，靈敏度高，分型的準確率高，為HPV的臨床分型檢測提供了可靠的方法，同時它還具有檢測通量高，檢驗成本低，操作方法簡便等優(yōu)點，能夠極大的提高檢驗工作效率，同時其對HPV的分型分析為疾病治療方案的選擇和HPV疫苗的研制都有很好的指導作用，適合臨床檢驗工作的需要。

表7 29種型別在HPV陽性樣本中出現(xiàn)的頻率分布(高至低排列)Tab.7 The distribution of HPV genotypes in the study population with HPV-positive

5HPV18145.4%6HPV39114.2%7HPV6114.2%8HPV5493.5%9HPV3183.1%10HPV5183.1%11HPV4483.1%12HPV3372.7%13HPV6872.7%14HPV3562.3%15HPV4362.3%16HPV1151.9%17HPV5351.9%18HPV6651.9%19HPV4541.5%20HPV5541.5%21HPV5931.1%22HPV4231.1%23HPV6731.1%24HPV4020.8%25HPV2610.4%26HPV5710.4%27HPV6910.4%28HPV7310.4%29HPV8210.4%

[1] EM de Villiers, C Fauquet, TR Broker, et al.缺題目， Virology, 2004，324(1): 17-27.

[2] Schiffman M H, H M Bauer, R N Hoover, et al. Epidemiologic evidence showing that human papillomavirus infection causes most cervical intraepithelial neoplasia[J]. J Natl Cancer Inst,1993,85: 958-964.

[3] Kjaer, S. K., A. J. van den Brule, J. E. Bock, et al. Human papillomavirus: the most significant risk determinant of cervical intraepithelial neoplasia[J]. Int J Cancer ,1996,5: 601-606.

[4] Walboomers JMM, Jacobs MV, Manos MM, et al. Huma papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide[J]. J Pathol,1999, 189: 12-19.

[5] Zur Hausen H. Papillomaviruses causing cancer: evasion from host cell control in early events in carcinogenesis[J]. J Natl Cancer Inst ,2000,2: 690-698.

[6] Lorincz A.. Hybrid Capture method of detection of human papillomavirus DNA in clinical specimens[J]. Papillomavirus Rep,1996,7:1-5.

[7] 曹友洪. 一種新型基因芯片技術(shù)在人乳頭瘤病毒( HPV)高通量基因分型檢測的應(yīng)用研究[J]. 生物醫(yī)學工程學進展, 2013，34(3)：157-164.