王漢偉，李 靜，王 景，高豐厚

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosis，SLE)為一病因未明的以多系統(tǒng)損害伴多種自身抗體形成為特征的自身免疫性疾病?；颊唧w內(nèi)可產(chǎn)生針對(duì)自身細(xì)胞核、胞質(zhì)及胞膜抗原的抗體。臨床常表現(xiàn)為發(fā)熱、面部紅斑、多形性皮疹、光過(guò)敏、多發(fā)性口腔潰瘍、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性漿膜炎、血管炎、腎炎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等。其中狼瘡腎炎(LN)常常是終末期患者常見(jiàn)的死亡原因，但狼瘡腎炎的病因至今尚未完全明確。主要認(rèn)為是由多因素所致，如遺傳、病毒感染免疫異常陽(yáng)光或紫外線(xiàn)的照射、某些藥物誘發(fā)及雌激素等引起的自身免疫炎性疾病。其引發(fā)的腎臟病變即LN 為典型的自身免疫復(fù)合物腎炎。研究表明，LN 存在多種細(xì)胞因子的異常表達(dá)，如CD147、IL-2、IL-6、IL-1、IL-4、MMP、TNF、TCAM-1、IFN 等在LN中表達(dá)均增高，說(shuō)明細(xì)胞因子參與了LN 的發(fā)病。本文用THP-1 細(xì)胞作為模型，觀察芍藥苷(paeoniflorin，PAE)對(duì)THP-1 細(xì)胞的CD147 的表達(dá)及MMP-9 分泌的影響，以探討芍藥苷治療狼瘡腎炎的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 THP-1 細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))，RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone 公司)，芍藥苷(上海扶生公司)，兔抗人CD147 抗體(BD 公司)，MMP-9 試劑盒(R﹠D 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人THP-1 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、50 U/ml 青霉素、50 μg/ml 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，每2～3 天換液1次。細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，1:2 傳代培養(yǎng)，THP-1 細(xì)胞呈單個(gè)圓形懸浮生長(zhǎng)，偶有細(xì)胞抱團(tuán)及貼壁生長(zhǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按1 ×106接種于六孔板中，用芍藥苷(10－5mol/L)干預(yù)后，置37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，正常細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。

1.2.2 Western blot 檢測(cè)CD147 蛋白的表達(dá)水平 收集同前處理的細(xì)胞，按1 ×106個(gè)細(xì)胞加入150 μl 的細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。制備12% SDS-PAGE 分離膠及5%的濃縮膠。根據(jù)樣品蛋白濃度，按總蛋白量為20μg 計(jì)算每孔上樣體積。電泳，轉(zhuǎn)膜，再染色、洗膜，5%的脫脂奶粉封閉1～2 h，雜交袋內(nèi)結(jié)合CD147-抗體(1:1 000)，HRP 標(biāo)記鼠抗GAPDH(1:3 000)作為內(nèi)參，4 ℃孵育過(guò)夜。次日RT 搖床上搖晃孵育1 h，TBS-T 洗膜10 min ×3 次，二抗加入HRP 標(biāo)記的IgG1(1:2 500)，RT 下孵育2 h 后，TBS-T 洗膜2 次，再用TBS 洗膜1 次。用ECL 化學(xué)發(fā)光顯色，曝光顯影，沖洗X 線(xiàn)片，所得底片在成像系統(tǒng)中拍照，用Quantity one 軟件分析得灰度值。分析CD147 總蛋白表達(dá)水平的變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 ELISA 法檢測(cè)MMP-9 按照試劑盒提供的方法，往每個(gè)孔中加入100μl 的Assay Diluent RD1-34。加100μl 的標(biāo)準(zhǔn)物，對(duì)照或是樣品到每孔內(nèi)，用封板膜封住。在RT 下孵育2 h。用400μl 的Wash Buffer 清洗。加200 μl 的MMP-9 Conjugate 到每個(gè)孔中，用新的橡膠膏條封住，在RT 下?lián)u晃孵育1 h。向每孔加入200 μl 的顯色試劑，RT 避光孵育30 min。向每孔加入50 μl 的終止液，顏色應(yīng)該由藍(lán)色變?yōu)辄S色。酶標(biāo)儀設(shè)定450 nm，在加終止液30 min 內(nèi)讀孔。

2 結(jié)果

2.1 Western blot 檢測(cè)結(jié)果 以芍藥苷(10－5mol/L)干預(yù)THP-1 細(xì)胞48 h 后收集細(xì)胞，Western blot 檢測(cè)THP-1 細(xì)胞CD147 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示以芍藥苷(10-5mol/L)干預(yù)THP-1 細(xì)胞后，與正常對(duì)照組相比明顯抑制了CD147 蛋白水平，CD147 蛋白平均分子量為58 kDa，GAPDH 內(nèi)參為37 kDa。分析計(jì)算EMMPRIN/GAPDH 灰度比值(P＜0.05)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 芍藥苷干預(yù)THP-1 細(xì)胞48 h 后CD147 蛋白灰度值變化(±s)

表1 芍藥苷干預(yù)THP-1 細(xì)胞48 h 后CD147 蛋白灰度值變化(±s)

2.2 ELISA 法檢測(cè)MMP-9 以芍藥苷(10－5mol/L)干預(yù)THP-1 細(xì)胞48 h 后收集細(xì)胞上清，ELISA 法檢測(cè)THP-1 細(xì)胞分泌MMP-9 表達(dá)量。結(jié)果顯示以芍藥苷(10－5mol/L)干預(yù)THP-1 細(xì)胞后，與正常對(duì)照組相比，上清中MMP-9 濃度明顯下降，與未干預(yù)對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 芍藥苷干預(yù)THP-1 細(xì)胞48 h 后MMP-9 分泌量變化(±s)

表2 芍藥苷干預(yù)THP-1 細(xì)胞48 h 后MMP-9 分泌量變化(±s)

3 討論

SLE 是一種多器官受累的自身免疫性疾病，血管炎是SLE 的基本病理改變，最常累及皮膚和腎臟，但也可累及包括中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的許多臟器，并且血管炎與SLE 患者的死亡率密切相關(guān)，因此對(duì)血管炎的抑制在SLE 的治療中占有重要意義［1］?；顒?dòng)性L(fǎng)N 如不及時(shí)控制，可迅速引起衰竭而死亡［2］。

CD147 為一分子量為58KD 的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，MMPs 是一組含鋅的鈣離子依賴(lài)蛋白，屬肽鏈內(nèi)切酶家族，主要參與細(xì)胞外基質(zhì)的代謝，MMP-9 屬明膠酶，主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、炎癥、腫瘤、結(jié)締組織疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用［3］。MMP-9通過(guò)降解血管基底膜的主要成分，使內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，有利益炎癥細(xì)胞侵入血管壁引起炎癥反應(yīng)，并與TNF-a 和IL-1B等細(xì)胞因子相互作用放大炎癥反應(yīng)，參與SLE 發(fā)病的多個(gè)環(huán)節(jié)［4］。有研究表明［5］SLE 活動(dòng)期PBMC 中CD147 mRNA 的表達(dá)水平顯著高于正常人。用ELISA 方法檢測(cè)健康人和SLE 患者的血清MMP-9 濃度，顯示SLE 患者血清MMP-9 濃度降低，活動(dòng)期較穩(wěn)定期濃度也降低，同時(shí)用糖皮質(zhì)激素治療后MMP-9 濃度也降低，因此認(rèn)為MMP-9 可以作為反映SLE 疾病活動(dòng)程度、腎臟損害及疾病改善的指標(biāo)之一［6］。MMP-9 的過(guò)度產(chǎn)生可誘導(dǎo)微血管的損傷加劇內(nèi)皮細(xì)胞損傷促進(jìn)炎癥細(xì)胞穿過(guò)基底膜從而更衣導(dǎo)致血管炎的發(fā)生［7］。既往研究表明SLE患者血清PBMCsCD147 的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組，且與患者病情活動(dòng)呈正相關(guān)，同時(shí)MMP-9 分泌也增高，通過(guò)相關(guān)性分析表明SLE 患者PBMCs 表面CD147 的表達(dá)與PBMCs 分泌MMP-9 的能力正相關(guān)，與PBMCsMMP-9 m-RNA 的表達(dá)正相關(guān)，因此推測(cè)SLE 患者PBMCs 高表達(dá)的CD147 誘導(dǎo)MMP-9分泌增多［8］。PAE 是芍藥的主要活性單體成分，毒性極低，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)等多種作用。目前其合成化合物白芍總苷已經(jīng)是批準(zhǔn)的治療風(fēng)濕免疫性疾病的臨床用藥，PAE 是其主要化學(xué)成分，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予PAE 干預(yù)THP-1 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其表達(dá)CD147 水平是下降的同時(shí)MMP-9 分泌也是減少的，這與文獻(xiàn)報(bào)道也是相一致的，這也為PAE 治療LN 提供了理論依據(jù)及可能的機(jī)制。

［1］ Takeuchi T，Aoki K，Koide J，et al. Systemic lupus erythematosus with necrotizing vasculitis and upregulated expression of VLA-4 antigen［J］.Clin Rheumatol，2009，14(3):370-374.

［2］ 符 勇，肖湘云，唐 虹.狼瘡腎炎患者治療方案與病理分型關(guān)系的探討［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2013，19(01):33-35.

［3］ Srivastava A，Pastor-Pareja JC，Igaki T，et al. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion［J］.Proc Natl Aead Sei US A，2007，104(8):2721-2726.

［4］ Saren P，Welgus HG，Kovanen PT. TNF-alpha and IL-l beta selectively induce expression of 92-kDa gelatinase by human macrophages［J］.J Immunol，2006，157(9):4159-4165.

［5］ 邱 英，陳 翔，魯 慧，等. CD147 與P 糖蛋白在SLE 患者外周血單一和細(xì)胞表達(dá)［J］. 中華皮膚科雜志，2010，43(1):52-53.

［6］ 謝立虎，陳戰(zhàn)瑞，趙 鋮，等.SLE 患者血清MMP-9、TIMP-1 水平測(cè)定及其臨床意義［J］.內(nèi)科，2012，7(2):101-104.

［7］ Trysberg E，Blennow K，Zachrisson O，et al.Intrathecal levels of matrix metalloproteinases in systemic lupus erythematosus with central nervous system engagement［J］. Arthritis Res Ther，2004，6(6):551-556.

［8］ Deage V，Burger D，Dayer JM.Exposure of T lymphocytes to leflunomide but not to dexamethasone favors the production by monocytic cells of interleukin-1 receptor antagonist and the tissue-inhibitor of metalloproteinases-1 over that of interleukin-l beta and metalloproteinases［J］.Eur Cytokine Netw，2008，9(4):663-668.