王軍力， 肖國強， 曹 姣， 李俊華

(1．懷化學(xué)院 體育系，湖南 懷化418008;2．華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州510006)

胰島素信號(INS-IR-IRS-PI3K-AKT/PKB)通路障礙是Ⅱ型糖尿病(T2DM)發(fā)生和發(fā)展的重要誘因［1－2］。在胰島素抵抗和T2DM大鼠中，胰島素刺激的PI3K和AKT的活化都受到影響［3－4］。SIRT1是酵母染色質(zhì)沉默因子sir2(silent information regulator 2)同源體，是一種NAD+依賴的組蛋白脫乙?；福?］。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，細(xì)胞SIRT1表達(dá)降低，SIRT1表達(dá)增加能夠改善胰島素的敏感性［6］;因此，SIRT1與糖代謝之間存在著密切聯(lián)系。那么，T2DM骨骼肌SIRT1表達(dá)是否降低?運動訓(xùn)練能否誘導(dǎo)T2DM骨骼肌SIRT1表達(dá)增加?SIRT1表達(dá)增加與運動改善T2DM胰島素信號通路障礙是否有關(guān)尚不明確。白藜蘆醇(Resveratrol，Rv)是一種天然的多酚類化合物。在細(xì)胞培養(yǎng)的條件下，白藜蘆醇能明顯促進SIRT1表達(dá)和活性升高［7］，在在體條件下，白藜蘆醇通過激活SIRT1或誘導(dǎo)SIRT1表達(dá)明顯改善胰島素的敏感性，降低血糖［8］。白藜蘆醇的降糖效果是否依賴于對胰島素信號通路的影響?是否與SIRT1有關(guān)?運動訓(xùn)練和白藜蘆醇共同干預(yù)是否對T2DM胰島素信號通路影響有協(xié)同效應(yīng)?這些問題的答案尚不明確。本研究通過觀察7周游泳訓(xùn)練和白藜蘆醇干預(yù)對T2DM大鼠骨骼肌SIRT1表達(dá)的影響，探討SIRT1在運動訓(xùn)練和白藜蘆醇單獨或共同干預(yù)對影響T2DM大鼠骨骼肌胰島素信號通路中的作用。

1 實驗材料與方法

1．1 Ⅱ型糖尿病模型構(gòu)建 將6周齡SPF級雄性SD大鼠［購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號為SCXX(粵)2008－0002粵鑒證字2008D007］適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后［動物房溫度為(25±1)℃，濕度為55% ±5%，光照周期12 h］，隨機分為對照組和高脂組。對照組喂養(yǎng)普通飼料，高脂組喂養(yǎng)高脂飼料，高脂飼料配方為20%(質(zhì)量比)蔗糖，10%(質(zhì)量比)豬油，5%(質(zhì)量比)蛋黃粉，0．2%(質(zhì)量比)膽酸鈉，64．8%(質(zhì)量比)基礎(chǔ)飼料。2組大鼠自由飲食和飲水，飼養(yǎng)條件相同。5周后，對高脂組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(35 mg/kg bw［9］)，7 d后斷尾取血測試隨機血糖，血糖濃度≥16．7 mmol/L為建模成功。

1．2 實驗分組 建模成功后，將T2DM大鼠隨機分為對照組(D)、運動組(DE)、白藜蘆醇給藥組(DR)和白藜蘆醇給藥運動組(DER)，另設(shè)一組正常對照組大鼠(C)，每組8只，所有大鼠均以普通飼料喂養(yǎng)。

1．3 運動方案 大鼠的運動方式采用不負(fù)重游泳訓(xùn)練，游泳在白色大水桶中進行(無水流)，每桶4只，水深60 cm，水溫為(32±2)℃，1周的適應(yīng)性訓(xùn)練(10 min/d)后進行7周正式訓(xùn)練，第1周30 min/d，第2周45 min/d，第3～7周60 min/d。每周訓(xùn)練6 d。

1．4 白藜蘆醇灌胃處理 白藜蘆醇(湖南洪江華光生物有限責(zé)任公司)溶于雙蒸水中制成(6 mg/mL)懸濁液。每天11:00按照45 mg/kg對大鼠進行灌胃處理，每周灌胃7 d。對照組大鼠灌胃雙蒸水。

1．5 實驗取材 停止干預(yù)36 h后(避免急性運動效應(yīng))禁食12 h，檢測空腹血糖和血胰島素，之后按照2 g/kg bw灌胃葡萄糖進行葡萄糖耐量實驗(OGTT)，灌胃后30 min、60 min和120 min尾靜脈取血檢測血糖濃度和血胰島素濃度。次日利用10%水合氯醛(3．5 mL/kg bw)對大鼠進行麻醉后腹腔注射結(jié)晶牛胰島素(7 U/kg bw)，5 min后宰殺大鼠，取比目魚肌，置于液氮罐中備用。

1．6 主要實驗儀器、試劑及材料 實驗儀器:JPS-5怡成血糖儀及試紙條(北京怡成);ELX-808酶標(biāo)儀(美國寶特);電泳儀(瑞典Amersham);凝膠圖像分析儀(Alpha Inno tech)。

實驗試劑及材料:結(jié)晶牛胰島素(Sigma);PVDF膜(Milli pore);辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(武漢博士德);胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒(上海藍(lán)基);兔抗大鼠SIRT1、PTP1B、AKT、IRS-1 、pIRS-1-Ser307多克隆抗體(北京博奧森)。

1．7 檢測指標(biāo)及方法 采用JPS-5怡成血糖儀測試(電化學(xué)法)血糖濃度;采用ELISA方法測試血胰島素濃度;采用 Western-blot方法檢測比目魚肌 SIRT1、AKT、pAKT-Ser473、IRS-1、pIRS-1-Ser307、PTP1B 蛋白表達(dá)。Western-blot檢測步驟為:SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(350 mA，1 h)，室溫下PVDF膜用TBS/T封閉液(TBS含有0．1%Tween-20，5%脫脂奶粉)中孵育2 h，TBS/T緩沖液漂洗3次，每次5 min。用一抗稀釋液(TBS/T含有5%BSA)稀釋一抗(抗體均為1∶1 000配制)，4℃下孵育PVDF膜過夜。TBS/T緩沖液漂洗膜3次，每次5 min，再將膜與二抗(1∶5 000，封閉液稀釋)室溫下孵育1 h，TBS/T緩沖液漂洗。將化學(xué)發(fā)光試劑A液與B液等量混合，孵育PVDF膜1 min，于凝膠成像儀中成像。

1．8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 應(yīng)用SPSS13．0軟件對各組數(shù)據(jù)進行分析，采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用配對t檢驗和雙因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，P＜0．05為顯著性差異，P＜0．01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同組別大鼠體重變化情況(表1)

2．2 空腹和OGTT后不同組別大鼠血糖和血胰島素變化情況

2．2．1 不同組別大鼠血糖變化情況(表2)

2．2．2 不同組別大鼠血胰島素變化情況(表3)

2．3 不同組別大鼠比目魚肌 SIRT1、AKT、pAKTSer473、IRS-1、p IRS-1-Ser307和 PTP1B 蛋白表達(dá)的比較T2DM大鼠SIRT1表達(dá)非常顯著性降低(P＜0．01)，運動訓(xùn)練和白藜蘆醇單獨或共同干預(yù)明顯升高T2DM大鼠比目魚肌SIRT1表達(dá)(P＜0．01)，兩者共同干預(yù)較單獨干預(yù)效果更明顯(P＜0．05)(圖2)。不同組別大鼠比目魚肌AKT表達(dá)量無顯著性差異(P＞0．05)(圖3)。T2DM大鼠pAKT-Ser473的含量非常顯著性降低(P＜0．01)，運動訓(xùn)練和白藜蘆醇單獨或共同干預(yù)明顯升高T2DM大鼠比目魚肌pAKT-Ser473的含量(P＜0．01)，兩者共同干預(yù)較單獨干預(yù)效果更明顯(P＜0．05)(圖4)。

表1 不同組別大鼠體重變化情況 gTable 1 The Changes of Body Weight after 7-Week Exercise and/or Resveratrol

表2 不同組別大鼠OGTT后血糖濃度情況 mmol/LTable 2 The Changes of Plasma Glucosecontent after 7-Week Exercise and/or Resveratrol

表3 不同組別大鼠OGTT后血漿胰島素變化情況 ng/mLTable 3 The Changes of Plasma Insulin Content after 7-Week Exercise and/or Resveratrol

圖1 不同組別大鼠蛋白表達(dá)圖譜Figure 1．Protein Expression Profile in Different Groups

圖2 不同組別大鼠SIRT1表達(dá)變化情況Figure 2．The Changes of the Expressions of SIRT1 after 7-Week Intervention

圖3 不同組別大鼠AKT表達(dá)變化情況Figure 3．The Changes of the Expressions of AKT after 7-Week Intervention

圖4 不同組別大鼠pAKT-Ser473表達(dá)變化情況Figure 4．The Changes of the Expressions of AKT after 7-Week Intervention

不同組別大鼠比目魚肌IRS-1表達(dá)量無顯著性差異(P＞0．05)(圖5)。T2DM大鼠pIRS-1-Ser307含量顯著性升高(P＜0．01)，運動訓(xùn)練和白藜蘆醇單獨或共同干預(yù)明顯降低比目魚肌 pIRS-1-Ser307含量(P＜0．01)，兩者共同干預(yù)較單獨干預(yù)降低效果更明顯(P＜0．05)(圖6)。T2DM大鼠PTP1B表達(dá)明顯升高(P＜0．01)，運動訓(xùn)練和白藜蘆醇單獨或共同干預(yù)明顯降低比目魚肌PTP1B表達(dá)(P＜0．01)，兩者共同干預(yù)較單獨干預(yù)降低效果更明顯(P＜0．05)(圖7)。

圖5 不同組別大鼠IRS-1表達(dá)變化情況Figure 5．The Changes of the Expressions of IRS-1 after 7-Week Intervention

圖6 不同組別大鼠pIRS-1-Ser307變化情況Figure 6．The Changes of the Expressions of pIRS-1-Ser307 after 7-Week Intervention

圖7 不同組別大鼠比目魚肌PTP1B表達(dá)變化情況Figure 7．The Changes of the Expressions of PTP1B after 7-Week Intervention

3 討論

3．1 Ⅱ型糖尿病大鼠骨骼肌胰島素信號通路障礙本文構(gòu)建的T2DM大鼠空腹血糖和血胰島素濃度顯著高于正常大鼠，OGTT后30 min、60 min和120 min，T2DM大鼠血糖和血胰島素濃度均顯著高于正常大鼠對應(yīng)時間點血糖和血胰島素濃度，存在明顯的糖耐量受損，提示本研究構(gòu)建的T2DM大鼠可能存在胰島素信號通路障礙。

Ser473磷酸化程度反映胰島素刺激的AKT活化的程度［10］，在胰島素抵抗的肥胖個體中，胰島素刺激的AKTSer473磷酸化程度降低［11］。本文發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠比目魚肌AKT未發(fā)生明顯變化，而胰島素刺激的比目魚肌 pAKTSer473水平降低。為觀察胰島素刺激的pAKTSer473的水平降低是否受到胰島素信號通路上游蛋白和信號通路負(fù)性調(diào)節(jié)因子的影響，本實驗檢測了PTP1B、IRS-1和pIRS-1-Ser307的水平。PTP1B是體內(nèi)廣泛表達(dá)的胰島素作用的負(fù)性調(diào)節(jié)因子［12］。其在骨骼肌中含量豐富［13］，通過逆轉(zhuǎn)IR和IRS酪氨酸磷酸化，抑制IR和 IRS的激活［14－15］。本文發(fā)現(xiàn) T2DM 大鼠比目魚肌PTP1B表達(dá)顯著升高，PTP1B表達(dá)增加可能是造成T2DM胰島素信號通路障礙的原因之一。IRS-1是胰島素信號通路上游蛋白，pIRS-1-Ser307磷酸化程度增加會導(dǎo)致IRS-1酪氨酸磷酸化和AKT磷酸化水平降低［16］。本文T2DM大鼠比目魚肌IRS-1表達(dá)與正常組大鼠比較無明顯變化，但pIRS-1-Ser307水平明顯提高。本文構(gòu)建T2DM大鼠胰島素信號通路障礙可能部分是由PTP1B表達(dá)增加和pIRS-1-Ser307水平升高所致。

3．2 運動訓(xùn)練對Ⅱ型糖尿病大鼠骨骼肌胰島素信號通路及SIRT1表達(dá)的影響 研究表明，7周游泳訓(xùn)練沒有改變T2DM大鼠比目魚肌AKT和IRS-1表達(dá)，這與E．Luciano等［17］的研究結(jié)果一致。誘導(dǎo)胰島素刺激的pAKT-Ser473的水平升高，說明運動訓(xùn)練明顯提升比目魚肌AKT的活性，改善胰島素信號通路障礙。檢測血糖和血胰島素發(fā)現(xiàn)，7周游泳訓(xùn)練明顯減輕了T2DM大鼠OGTT受損程度，OGTT后30 min、60 min和120 min，血糖濃度均明顯低于T2DM對照組大鼠對應(yīng)時間點的濃度，空腹和OGTT后30 min、60 min血胰島素濃度明顯低于對照組對應(yīng)時間點濃度，提示骨骼肌對胰島素敏感性明顯提高。同時，盡管與T2DM對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，通過7周游泳干預(yù)在一定程度上改善了T2DM大鼠體重。PTP1B作為胰島素信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子被廣泛引起注意。G．D．Wadley等［18］發(fā)現(xiàn)，急性運動沒有改變不經(jīng)常訓(xùn)練人群骨骼肌PTP1B表達(dá)，而 R．Jose'等［19］研究表明急性運動誘導(dǎo)老年鼠骨骼肌PTP1B表達(dá)降低。本文發(fā)現(xiàn)7周游泳訓(xùn)練導(dǎo)致T2DM大鼠比目魚肌PTP1B表達(dá)顯著降低。有研究結(jié)果［19］顯示，老年鼠進行急性運動能明顯降低骨骼肌pIRS-1-Ser307的水平。本文研究表明7周游泳訓(xùn)練顯著降低pIRS-1-Ser307水平，因此，運動訓(xùn)練可能通過降低骨骼肌PTP1B和pIRS-1-Ser307的水平改善骨骼肌胰島素信號通路障礙。

在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，細(xì)胞 SIRT1表達(dá)降低，SIRT1表達(dá)增加能夠改善胰島素的敏感性［6］。本文發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠比目魚肌SIRT1表達(dá)顯著降低，這可能是T2DM胰島素信號通路障礙原因之一。先前研究結(jié)果［20］顯示急性運動和14 d低強度耐力訓(xùn)練導(dǎo)致正常大鼠比目魚肌SIRT1表達(dá)明顯增加，本文首次發(fā)現(xiàn)7周游泳訓(xùn)練提高了T2DM大鼠比目魚肌SIRT1表達(dá)。那么7周游泳訓(xùn)練提高T2DM大鼠骨骼肌SIRT1表達(dá)是否與運動訓(xùn)練改善胰島素的敏感性有關(guān)，尚不明確。研究結(jié)果顯示，SIRT1能夠抑制PTP1BmRNA的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致 PTP1B 表達(dá)下降［6］。

本文發(fā)現(xiàn)運動訓(xùn)練誘導(dǎo)T2DM大鼠比目魚肌SIRT1表達(dá)增加的同時，T2DM大鼠比目魚肌PTP1B表達(dá)顯著降低;因此，運動訓(xùn)練改善T2DM胰島素信號通路障礙，可能部分是通過運動訓(xùn)練誘導(dǎo)SIRT1表達(dá)抑制PTP1B表達(dá)實現(xiàn)的。T．Takeshi等［21］研究發(fā)現(xiàn)，利用SIRT1激活劑處理3T3－L1細(xì)胞會降低pIRS-1-Ser307的水平，改善了胰島素的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)7周游泳訓(xùn)練后，pIRS-1-Ser307水平降低，這可能與運動訓(xùn)練誘導(dǎo)比目魚肌SIRT1表達(dá)增加有關(guān);因此，運動訓(xùn)練改善T2DM大鼠胰島素抵抗可能是通過SIRT1-PTP1B和SIRT1-pIRS-1-Ser307途徑，即運動訓(xùn)練誘導(dǎo)SIRT1表達(dá)抑制PTP1B表達(dá)和降低pIRS-1-Ser307水平，改善胰島素信號通路障礙。

3．3 白藜蘆醇對Ⅱ型糖尿病大鼠骨骼肌胰島素信號通路及SIRT1表達(dá)的影響 白藜蘆醇對糖尿病大鼠具有降血糖作用，其降血糖作用是否與其改善胰島素信號通路有關(guān)尚不明確。本文發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預(yù)T2DM大鼠7周后，OGTT表明T2DM大鼠糖耐量明顯改善，白藜蘆醇給藥組在OGTT后30 min、60 min和120 min血糖和血胰島素濃度明顯低于T2DM對照組大鼠對應(yīng)時間點的濃度，這與 C．Sun等［6］的研究類似。通過7周白藜蘆醇補充，T2DM大鼠體重在一定程度得到了改善，但與T2DM對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。Liu Kang等發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇明顯增加RAW264．7細(xì)胞IRS-1的含量，降低了pIRS-1-Ser307的水平。本文發(fā)現(xiàn)，7周白藜蘆醇給藥對T2DM大鼠比目魚肌IRS-1和AKT含量無明顯影響，但導(dǎo)致T2DM大鼠比目魚pIRS-1-Ser307的含量降低，胰島素刺激的pAKT-Ser473水平增加。C．Sun等［6］發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇明顯降低正常和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下PTP1B的水平。本文研究結(jié)果顯示白藜蘆醇顯著降低T2DM大鼠比目魚肌PTP1B的表達(dá)。

研究已證實白藜蘆醇能夠激活SIRT1或增加SIRT1表達(dá)。本文首次發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠誘導(dǎo)T2DM大鼠比目魚肌SIRT1表達(dá)明顯升高。7周白藜蘆醇給藥改善T2DM大鼠胰島素信號通路障礙是否與SIRT1表達(dá)有關(guān)呢?C．Sun等［6］的研究和本文均發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇誘導(dǎo)SIRT1表達(dá)增加抑制了PTP1B表達(dá)是改善胰島素敏感性可能機制之一，但是本文首次發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇誘導(dǎo)SIRT1表達(dá)抑制了pIRS-1-Ser307的水平可能也參與T2DM胰島素信號通路的改善。

3．4 運動訓(xùn)練和白藜蘆醇共同干預(yù)對Ⅱ型糖尿病大鼠骨骼肌胰島素信號通路及SIRT1表達(dá)的影響 本文首次探討運動訓(xùn)練和白藜蘆醇共同干預(yù)對骨骼肌胰島素信號通路蛋白及PTP1B表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，7周單獨游泳訓(xùn)練和白藜蘆醇共同干預(yù)對T2DM大鼠比目魚肌AKT和IRS-1的表達(dá)無顯著性影響，但顯著增加了胰島素刺激的pAKT-Ser473水平，且呈現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。兩者共同干預(yù)明顯抑制了PTP1B和pIRS-1-Ser307的表達(dá)，且抑制程度明顯高于兩者單獨干預(yù)對T2DM大鼠比目魚肌PTP1B和pIRS-1-Ser307的抑制作用，表明運動訓(xùn)練和白藜蘆醇共同干預(yù)比單獨干預(yù)更明顯改善了T2DM大鼠胰島素信號通路障礙。

本研究結(jié)果顯示，運動訓(xùn)練和白藜蘆醇共同干預(yù)誘導(dǎo)T2DM大鼠比目魚肌SIRT1表達(dá)顯著高于單獨干預(yù)誘導(dǎo)SIRT1的表達(dá)，具有協(xié)同效應(yīng)。兩者單獨干預(yù)明顯改善T2DM大鼠糖耐量受損，那么兩者共同干預(yù)對糖耐量的改善是否具有協(xié)同效應(yīng)?OGTT結(jié)果表明，兩者共同干預(yù)在葡萄糖灌胃后30 min、60 min和120 min血糖濃度明顯低于游泳訓(xùn)練或白藜蘆醇單獨干預(yù)對應(yīng)時間點血糖的濃度，提示兩者共同干預(yù)對糖耐量的改善具有協(xié)同效應(yīng)。這種協(xié)同效應(yīng)可能是由于兩者共同干預(yù)誘導(dǎo)SIRT1表達(dá)的協(xié)同效應(yīng)，從而對PTP1B和pIRS-1-Ser307的水平抑制程度的協(xié)同效應(yīng)造成的。

4 結(jié)論

7周游泳訓(xùn)練和白藜蘆醇單獨或共同干預(yù)均改善Ⅱ型糖尿病大鼠糖耐量受損，可能是通過抑制PTP1B表達(dá)和減少pIRS-1-Ser 含量，改善了胰島素信號通路障礙，從而增加骨骼肌對胰島素敏感性而實現(xiàn)的;而SIRT1作為PTP1B和pIRS-1-Ser307重要調(diào)節(jié)因子，游泳訓(xùn)練和白藜蘆醇單獨或共同干預(yù)誘導(dǎo)其表達(dá)增加可能起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。

7周游泳訓(xùn)練和白藜蘆醇共同干預(yù)對SIRT1表達(dá)具有協(xié)同效應(yīng)，對PTP1B和pIRS-1-Ser307的抑制程度也具有協(xié)同效應(yīng)，較單獨干預(yù)更明顯地改善糖耐量受損，更好地改善了胰島素信號通路障礙。

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