王 茹， 羅貝貝， 張亞軍， 王紅霞， P．R．Mabounda Kounga， 陳佩杰

(上海體育學院運動健身科技省部共建教育部重點實驗室，上海200438)

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是現(xiàn)代醫(yī)學中發(fā)現(xiàn)的一種疾病。目前，CFS的發(fā)病機制尚不清楚，臨床也缺乏特異的診斷標準和有效的治療方法［1］。近年有研究發(fā)現(xiàn):CFS患者腸道菌群異常改變，胃腸道功能紊亂，黏膜免疫失衡，促炎因子水平升高［2］，提示腸道菌群異常相關的腸黏膜免疫屏障功能紊亂可能參與了CFS的發(fā)生［3］。腸上皮間淋巴細胞(intestinal intraepithelial lymphocytes，iIEL)在消化道中的數量極其龐大且由多個T細胞亞群組成，其中以γδT細胞所占的比例最大。已知γδT細胞是一類重要的固有免疫細胞，主要分布在黏膜和上皮組織，在維持和調節(jié)正常黏膜免疫功能中發(fā)揮重要作用［4］。本研究通過流式細胞術分析γδT細胞在慢性疲勞綜合征建模小鼠腸上皮間淋巴細胞中所占的比例，試圖從腸道黏膜免疫的角度探討CFS的發(fā)病機制。此外，鑒于適宜低氧引發(fā)的良性生物學效應，本研究進一步觀察不同程度低氧暴露對CFS小鼠腸上皮內γδT細胞的影響，為治療CFS患者提供新思路。

1 研究方法

1．1 動物與分組選取72只30～40 g的SPF級雄性ICR小鼠作為實驗對象，分籠飼養(yǎng)，每籠6只，自由飲食，保持飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(23±2)℃，濕度為55% ±15%，實驗動物由上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供［SCXK(滬)2008－0016］。所有小鼠被隨機分為6組，每組12只，即正常對照組(C0組)、慢性疲勞綜合征建模組(CFS0組)、低氧干預正常對照組(C組)、慢性疲勞綜合征低氧干預對照組(CFS組)、慢性疲勞綜合征+15%氧濃度低氧暴露組(15%H組)和慢性疲勞綜合征+18%氧濃度低氧暴露組(18%H組)。其中，CFS0組、CFS組、15%H組和18%H組采用束縛和強迫游泳方式建立慢性疲勞綜合征小鼠模型(建模方案如表1所示)，C0組和C組在同等條件下正常飼養(yǎng)。建模完成后C0組和CFS0組立即處死，用于檢驗建模效果。C組繼續(xù)飼養(yǎng)7 d，CFS組自然恢復7 d，15%H組和18%H組分別在15%和18%氧濃度環(huán)境暴露7 d(1 h/d，低氧干預方案見表2)，低氧設備為美國 HYPOXIC SYSTEMS公司 HYP－123型低氧發(fā)生器。

1．2 行為學測試 CFS建模第5周進行水迷宮測試。水迷宮測試相關實驗設備均由安徽淮北正華生物儀器設備有限公司生產，視頻處理借助美國ANY－maze動物行為學視頻分析系統(tǒng)完成。

Morris水迷宮測試用于測定小鼠的空間學習記憶能力。Morris水迷宮測試分為隱藏平臺獲得實驗和移開平臺空間搜索實驗2個部分，水面背景采用黑色食用色素著染，測試順序參照 C．V．Vorhees等［5］建議的方案。1)隱藏平臺獲得實驗:平臺置于任一象限水面下1．5 cm處，每天訓練4次，持續(xù)5 d，小鼠入水時面向池壁，找到隱藏平臺后立即停止試驗，儀器自動記錄小鼠從入水到發(fā)現(xiàn)隱藏平臺的時間即逃避潛伏期。如果小鼠在120 s內未能找到平臺，由實驗者將其引導至平臺停留15 s，逃避潛伏期記為120 s。2)移開平臺空間搜索實驗:在Morris水迷宮測試的第6天移去隱藏平臺，任意選取一個入水點將小鼠面向池壁放入水中，儀器自動記錄60 s內小鼠在各個象限停留的時間，記錄在平臺所在象限停留時間。

表1 CFS建模方案Table 1 CFS Mice Model Induced by Chronic Restraint and Forced Swimming

表2 低氧干預方案Table 2 Hypoxia Intervention Scheme

1．3 腸道iIEL分離方法

1．3．1 實驗器材 RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，Percoll分離液購自美國Sigma公司，流式抗體以及相關試劑購自美國Beckman Coulter公司。磷酸鹽緩沖溶液(10×PBS溶液)、Hank’s溶液、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫蘇糖醇(DTT)、5%胎牛血清(FCS)、多聚賴氨酸、多聚甲醛、生理鹽水等常規(guī)試劑藥品均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

眼科剪、培養(yǎng)皿、50 mL離心管、15 mL離心管、200目篩網購自上海國藥集團化學試劑有限公司。儀器設備:移液器(德國eppendorf)，振蕩水浴箱(上海比郎儀器有限公司生產)，低溫離心機(上海飛鴿 DL－4000B)，病理診斷系統(tǒng)(德國Leica公司提供)，Epics XL流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司生產)，倒置相差顯微鏡(美國Olympus公司生產)，GDS－8000圖像采集分析系統(tǒng)(美國UVP公司提供)。

1．3．2 iIEL分離方案 嚙齒類實驗動物iIEL的分離方法最早建立于1981年［6］。國內外許多學者對分離方法進行了改進:梯度密度離心、篩網或尼龍毛過濾［7］;分離過程中大部分使用了DTT與EDTA等螯合劑作為消化液以及用冷生理鹽水(4℃)沖洗管腔［8］;低溫下靜置的時間、搖床振蕩的力度和2層Percoll界面間的細胞層是否吸取完全是影響小鼠iIEL分離收獲率的主要因素，此外分離過程中的人為因素(熟練程度)也影響iIEL的獲得量［9］。本實驗采用2009年Binda等改良的分離小鼠iIEL方法［10］，并由專人操作以減少誤差。具體步驟如下。

第一，Percoll工作液的配制:Percoll原液與10×PBS溶液按體積比9∶1混合，制成100%等滲Percoll。100%等滲Percoll與1×PBS溶液按體積比7∶3和4∶6混合，制成70%等滲Percoll溶液和40%等滲Percoll溶液。

第二，iIEL的制備:頸椎脫臼法處死小鼠，剖開腹腔，小心取出小腸置于預先制冷的含5%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液中。在冷生理鹽水中沖洗，去除腸系膜和集合淋巴小結?？v向剪開小腸，再用冷生理鹽水沖洗至腸內外壁均無殘留物。將小腸剪成5 mm大小的碎片，移入50 mL離心管中靜置沉淀，吸去上清液。加入30 mL消化液(在無Ca2+、Mg2+的Hank’s溶液中加入2 mmol/L DTT與5 mmol/L EDTA)，置入恒溫振蕩水浴箱中，37 ℃，150 r/min，振蕩30 min，收集上清，重復2次。上清液通過200目尼龍網篩過濾后，4℃離心(400 g)10 min收集細胞，將細胞沉淀用預先配置的40%Percoll溶液3 mL重懸。

第三，iIEL的純化:取70%Percoll 4 mL鋪于15 mL離心管底部，再將上述3 mL的細胞懸液輕輕加于4 mL 70%Percoll溶液上，2層液體間可見形成清晰的分界面。4℃ 400 g離心30 min，小心吸取在2層分離液之間的細胞，用5倍以上體積的RPMI 1640培養(yǎng)液洗2遍、重懸，將所獲得的細胞用倒置顯微鏡計數。

1．3．3 流式檢測腸上皮內γδT細胞 100萬個細胞加入1μL的FITC標記的抗小鼠γδTCR和PE標記的抗小鼠CD3抗體，避光室溫下孵育30 min，用流式細胞儀檢測iIEL中的CD3+iγδT細胞的百分比。收集1萬個細胞用于數據分析，采用同型抗體作為陰性對照。熒光激發(fā)光波長為488 nm，PE及FITC熒光濾光片波長分別為575 nm和525 nm，分析系統(tǒng)軟件為SystemⅡ。

1．4 數據分析 所有數據以“均值±標準誤”表示，逃避潛伏期采用重復測量方差分析，其他指標采用單因素方差分析處理。所有數據處理由SPSS 17．0統(tǒng)計學軟件完成，其中P＜0．05表示具有顯著性差異。

2 研究結果

2．1 CFS建模及低氧干預過程中各組小鼠體重變化

表3顯示，CFS建模第1周C0組和CFS0組小鼠體重不存在顯著性差異，CFS 建模第2、3、4、5 周，CFS0組小鼠體重明顯低于C0組(P＜0．05)。

表3 CFS建模過程中小鼠體重的變化Table 3 CFSMice Weight Change during Chronic Restraint and Forced Swimming

2．2 CFS建模過程中行為學指標變化

2．2．1 CFS建模過程中小鼠潛伏期的變化 圖1顯示，CFS建模第5周C0組和CFS0組小鼠逃避潛伏期的變化，重復測量方差分析顯示，C0組與CFS0組小鼠逃避潛伏期存在顯著性差異(P＜0．05)，單因素方差分析顯示，在水迷宮測試第4天C0組潛伏期明顯比CFS0組短(P ＜0．05)。

圖1 CFS建模小鼠逃避潛伏期的變化Figure 1．The Escape Latency of CFSMice in Morris Water Maze

2．2．2 CFS建模過程中小鼠空間搜索能力的差異圖2顯示，CFS建模第5周末CFS0組小鼠停留在平臺所在象限時間明顯低于C0組(P＜0．05)。

圖2 CFS建模小鼠停留在平臺所在象限的時間差異Figure 2．The Time Spending in the Target Quadrant of CFSMice

2．3 流式細胞儀檢測γδT細胞在CD3+iIEL細胞中的百分比 圖3顯示，CFS建模第5周末CFS0組小鼠γδT細胞在 CD3+iIEL細胞中的百分比明顯低于C0組。

圖3 CFS建模時各組小鼠CD3+γδT細胞在iIEL細胞中所占的百分比Figure 3． Percentage of CD3+γδT Cells in Intestinal Intraepithelial Lymphocytes of CFSMice

CFS建模成功并進行為期1周的低氧干預后發(fā)現(xiàn):與 C組相比，CFS組和18%H組的 γδT細胞在CD3+iIEL細胞中所占的百分比顯著下降;15%H組的γδT細胞在CD3+iIEL細胞中所占的百分比與對照組無差異;15%H組γδT細胞在CD3+iIEL細胞中所占的百分比顯著高于CFS組和18%H組(圖4)。

3 討論

圖4 干預后各組小鼠CD3+γδT細胞在iIEL細胞中所占的百分比Figure 4． Percentage of CD3+γδT Cells in Intestinal Intraepithelial Lymphocytes of CFSMice after Hypoxia Intervention

Michael Maes提出CFS的發(fā)生是生理和心理因素綜合作用的結果，他認為:持續(xù)性的心理和生理(如劇烈運動等)應激易造成機體免疫及氧化－抗氧化平衡紊亂;當反復遭受外界病毒和細菌感染時，進一步惡化機體免疫，導致氧化抗氧化失衡狀態(tài)，誘發(fā)CFS，出現(xiàn)疲勞、肌肉疼痛及行為認知功能惡化等癥狀［11］。

鑒于CFS患者主要病癥，以生理、心理為切入點可能更加符合CFS的發(fā)病機制。目前關于CFS動物模型建立尚無統(tǒng)一標準:多數研究［12－15］采用注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、布魯氏桿菌 (Brucella abortus，BA)及多聚肌胞甘酸(poly I:C)等造成動物機體免疫紊亂進而誘發(fā)慢性疲勞綜合征;也有部分研究［16－20］采用強迫游泳或跑步等運動形式建立慢性疲勞綜合征動物模型，但建模時間各不相同。此類CFS動物模型往往偏重于CFS患者病癥的復制，忽略了生理、心理應激在CFS發(fā)生中的作用。基于此，本研究根據CFS發(fā)病的生理、心理學理論模式，采用束縛及強迫游泳方式建立CFS小鼠模型。

3．1 CFS建模效果 臨床對于CFS尚無特異性的診斷標準，相關研究多采用動物行為學相關指標判斷CFS建模效果，目前最為常用的是水迷宮測試。Morris水迷宮測試是英國心理學家Morris于20世紀80年代初設計并應用于大腦學習記憶機制研究的一種實驗手段，此方法已得到廣泛認可，并被大多數學者運用于從事動物空間學習記憶能力的相關研究。水迷宮測試主要包括隱藏平臺獲得實驗和移開平臺空間搜索實驗，其中前者主要通過逃避潛伏期的變化反映小鼠的學習能力，而后者主要通過穿越平臺所在象限的次數和停留在平臺所在象限的時間反映小鼠的記憶力水平。

研究證實，CFS建模動物學習記憶能力下降［21］，與CFS患者注意力和記憶力減退癥狀相符，提示可通過學習記憶能力評定、判斷CFS建模效果。本研究結果顯示:采用束縛和強迫游泳的方式成功建立以空間學習記憶能力減退為主要特征的CFS小鼠模型。

3．2 腸道γδT細胞免疫機能腸上皮間淋巴細胞(intestinal intraepithelial lymphocytes，iIEL)是腸道黏膜免疫屏障的主要組成部分，其數量極其龐大，每只鼠可達5×106～7×106個，主要位于腸道基底膜的腸腔面且在腸道的不同部位iIEL數量不相同(空腸最多，回腸次之，結腸較少)。iIEL受刺激后可分泌多種細胞因子，進而參與維持正常的腸道黏膜免疫功能，其作為一種特殊的淋巴細胞群體，長期與腸道菌群、病原體等接觸，在調節(jié)腸道黏膜抗感染免疫、維持腸道上皮細胞完整性和對食物等外來抗原的免疫耐受中發(fā)揮重要作用［22］。

iIEL由多個T細胞亞群組成，其中以γδT細胞所占的比例最大，可達30%～50%［22］。γδT細胞是適應性免疫系統(tǒng)的重要成員T細胞的一大亞類，由于其表面的TCR是由γ和δ鏈組成而命名。相對于αβT細胞而言，γδT細胞有許多特殊的天然免疫系統(tǒng)特性:γδTCR具有高度多樣性，不具MHC限制性和不依賴抗原的處理和呈遞過程，表明γδT細胞在抗感染中起第一線的防御作用［23］。早在1999年，Matrumoto等用轉基因鼠研究證明，TCRγδIEL通過合成分泌IFN－γ促進腸上皮細胞的分化、增殖和MHCⅡ類分子的表達［24］。此外，γδT細胞作為一種特殊的淋巴細胞群體，通過其活化后合成分泌的細胞因子及細胞毒活性在黏膜局部的抗感染免疫，維護上皮細胞的完整性及調節(jié)對外來抗原的免疫應答等方面起重要作用［24］，被稱作固有免疫與適應性免疫的橋梁細胞［25］。近年來，對γδT細胞的深入研究進一步表明了其能調控免疫反應具有毒殺多種癌細胞與被病毒感染的細胞的能力，但其對抗原的識別與αβT細胞并不相似。在歷經長期進化后，相比αβT細胞，γδT細胞以更廣泛、快速和直接的方式對體內應激事件做出應答［26］。

3．3 CFS建模小鼠腸上皮內γδT細胞的變化 大量研究表明，CFS可能存在免疫功能異常，包括慢性免疫激活、免疫細胞對多克隆刺激的反應性降低、慢性炎癥和細胞因子網絡紊亂等［27］。此外，還有研究認為，CFS患者免疫功能的異?？赡苡赡c道菌群紊亂引起，腸道菌群改變可能與CFS患者的認知及情緒狀態(tài)、特別是焦慮有一定關系［28］。有研究報道，補充含有益生菌的制劑能減輕CFS患者的壓力和疲憊［29］，甚至能改善神經認知功能［30］。同樣，一項隨機選取39名CFS患者雙盲的研究通過糞便樣本檢測和貝克焦慮量表發(fā)現(xiàn):服用干酪乳桿菌促進患者的腸道菌群和黏膜免疫功能平衡，并緩減CFS焦慮癥狀［31］。腸道菌群改變、黏膜屏障失調和小腸免疫異?？赡苁荂FS的發(fā)病機制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，CFS建模小鼠腸上皮間γδT細胞數量所占iIEL的百分比下降，提示CFS小鼠可能對體內應激事件做出應答的速度有所減弱，機體動員、發(fā)揮免疫監(jiān)視的作用有所下降。當反復遭受外界病毒和細菌感染時，進一步惡化機體免疫機能，導致 CFS的發(fā)生。

3．4 不同低氧濃度對CFS建模小鼠的影響 采取措施改善CFS小鼠腸上皮間γδT細胞的表達量，無疑有利于調節(jié)腸道菌群平衡從而維持正常的腸道黏膜免疫功能。近年來，“低氧與健康”的議題引起了國際生物醫(yī)學界的研究興趣［32－34］。低氧暴露作為一種生理性刺激，其對機體產生的生物學效應主要取決低氧刺激的強度和持續(xù)時間，急性低氧暴露或持續(xù)性的低氧暴露易于引起機體損傷，中等濃度且時間相對較短的低氧暴露往往對機體具有保護作用。適宜的低氧暴露可能對CFS患者腸道免疫的改善具有一定的積極意義，但至今尚無相關報道。此外，如何把控適宜的低氧暴露時間和濃度，尤其是對CFS患者，這可能更是解決相關問題的關鍵?；诖?，本研究在觀察CFS小鼠腸道γδT細胞表達量下降的基礎上，進一步探討不同濃度低氧暴露對CFS小鼠腸道上皮內γδT細胞的影響，為進一步研究低氧應用于治療CFS患者提供一定的實驗支撐。

如何選擇適宜的低氧暴露時間及低氧刺激強度是本研究的重點。當機體處于海拔5 100 m以上高度時，空氣氧濃度約為12%，機體動脈血氧飽和度約為75%左右，而正常動脈血氧飽和度為93%～98%，低于94%可認為機體處于缺氧狀態(tài)，低于70%可危及生命。對于CFS患者的治療，低氧濃度可能高于12%更為合適。本研究選擇15%和18%氧濃度為干預措施，探討不同濃度低氧暴露1 h對CFS建模小鼠腸道上皮內γδT細胞的影響。研究發(fā)現(xiàn)，15%H組γδT細胞在CD3+iIEL細胞中所占的百分比顯著高于CFS組和18%H組，15%H組γδT細胞在CD3+iIEL細胞中所占的百分比和C組無明顯差異，18%H組與CFS組γδT細胞在CD3+iIEL細胞中所占的百分比無差異。

該研究結果表明:采用18%低氧干預不能緩減CFS小鼠腸道黏膜免疫細胞的改變，15%低氧干預有利于改善CFS小鼠腸道黏膜γδT細胞的抑制狀況。其機制可能是:在適宜的間歇性低氧暴露刺激下，低氧誘導因子－1α(HIF-1α)合成增加，HIF-1α 不僅參與了機體的低氧耐受，而且它是維持細胞氧平衡和低氧反應基因表達的一個中心調節(jié)因子。HIF-1α蛋白活性適度地增加，調節(jié)許多靶基因及產物的表達以適應低氧，如血管內皮生長因子等表達增加，可能有助于改善腸黏膜微循環(huán)，提高腸道免疫功能。HIF-1α蛋白亦可通過多種途徑導致機體代謝降低、組織耐低氧能力提高等［35］。這些微環(huán)境的改變有利于機體的內源性保護。

4 小結

CFS建模小鼠腸上皮內γδT細胞數量占iIEL的百分比下降可能導致機體對應激事件做出應答的速度有所減弱，機體動員、發(fā)揮免疫監(jiān)視的作用有所下降;而每天1 h 15%低氧干預可有效提高CFS小鼠腸上皮內γδT細胞的表達，有利于改善CFS小鼠腸道黏膜免疫機能。這為今后CFS患者的治療提供新思路。

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