吳文珊,陳友鈴,孫伶俐,毛建萍,楊問(wèn)新,王愛(ài)芳

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350117)

基于28S,COI和Cytb基因序列的薜荔和愛(ài)玉子傳粉小蜂分子遺傳關(guān)系研究

吳文珊,陳友鈴*,孫伶俐,毛建萍,楊問(wèn)新,王愛(ài)芳

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350117)

薜荔和愛(ài)玉子均屬于?？崎艑僦参铮邽橥晃锓N的原變種與變種的關(guān)系，早期研究認(rèn)為這兩種榕樹(shù)與同一種傳粉榕小蜂(Wiebesiapumilae(Hill))建立了穩(wěn)定的互利共生關(guān)系，但近期在形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)、傳粉生物學(xué)等方面對(duì)二者的研究結(jié)果表明，薜荔傳粉小蜂和愛(ài)玉子傳粉小蜂之間可能發(fā)生了遺傳分化。實(shí)驗(yàn)用核糖體28SrDNAD1-D3區(qū)、線(xiàn)粒體Cytb及COI基因部分序列，對(duì)采自福建3個(gè)不同樣地的薜荔傳粉小蜂和3個(gè)不同品系的栽培愛(ài)玉子的傳粉小蜂進(jìn)行分析，結(jié)果表明：(1)薜荔傳粉小蜂和愛(ài)玉子傳粉小蜂的核糖體28S序列的堿基組成中A，T，G，C 4種含量較平均，C+G的平均含量(56%)稍高于A+T的含量(44%)。線(xiàn)粒體Cytb序列中A+T的含量(76.1%)明顯高于C+G的含量(23.9%)，COI序列中A+T的含量(71.9%)也明顯高于G+C的含量(28.1%)，這是膜翅目昆蟲(chóng)線(xiàn)粒體基因的普遍特征。在薜荔和愛(ài)玉子傳粉小蜂的線(xiàn)粒體Cytb及COI基因中，密碼子第三位點(diǎn)A+T的含量最高。(2)比較薜荔和愛(ài)玉子傳粉小蜂的3種分子標(biāo)記的變異范圍顯示，28S進(jìn)化速度較Cytb及COI序列慢，比較保守，更適合科、亞科等較高分類(lèi)單元的研究。薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂之間的親緣關(guān)系較近，采用Cytb與COI序列進(jìn)行分析更為精確。(3)用Cytb及COI序列對(duì)薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂之間的遺傳距離進(jìn)行分析顯示，薜荔傳粉榕小蜂個(gè)體間Cytb序列平均遺傳距離為0.0054，愛(ài)玉子傳粉小蜂個(gè)體間的Cytb遺傳距離為0.0164；薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂群體之間的Cytb序列平均遺傳距離為0.1385；COI序列的薜荔傳粉榕小蜂個(gè)體間遺傳距離為0.0048，愛(ài)玉子傳粉小蜂各樣本間平均遺傳距離為0.0102；薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂群體間COI序列平均遺傳距離為0.1896，兩群體間的遺傳距離(差異大于10%以上)明顯大于群體內(nèi)各樣本之間的遺傳距離，表明薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂之間已經(jīng)發(fā)生了很大的遺傳分化，其變異水平達(dá)到了種間分化水平，即薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂為兩個(gè)不同的種。

薜荔； 愛(ài)玉子； 榕小蜂； COI；Cytb；28S

薜荔(Ficuspumilavar.pumila)隸屬?？崎艑?，為攀援或匍匐灌木，主要分布于福建、江西、浙江、安徽、江蘇、臺(tái)灣、湖南、廣東、廣西、貴州、云南東南部、四川及陜西等地，被廣泛用于園林的綠化[1- 2]，愛(ài)玉子(Ficuspumilavar.awkeotsang)為薜荔的變種，是我國(guó)特有的植物，原產(chǎn)自臺(tái)灣，在福建、浙江等地少量的野生分布，目前在臺(tái)灣和大陸長(zhǎng)江以南有廣泛栽培[1,3]。

薜荔和愛(ài)玉子在植株性狀、莖葉形態(tài)、花與花序的形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面均十分相似，二者究竟是原變種與變種的關(guān)系，擬或?yàn)椴煌膬蓚€(gè)種，長(zhǎng)期以來(lái)爭(zhēng)論不休。李和惠用trnT-trnL序列和核內(nèi)NIA-i3和ITS2序列對(duì)薜荔和愛(ài)玉子植株進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，核內(nèi)NIA-i3和ITS2序列兩者之間不存在差異，trnT-trnL序列上存在微小差異，認(rèn)為兩者為同一個(gè)種[4]。而林贊標(biāo)的研究表明，愛(ài)玉子瘦果中的果膠甲酯酶的活性(95.8活性單位)比薜荔(4.8活性單位)高很多，且愛(ài)玉子果膠甲酯酶有兩個(gè)亞型，在薜荔果膠甲酯酶只有一個(gè)亞型[5]，暗示薜荔和愛(ài)玉子可能是親緣關(guān)系很近的兩個(gè)不同的種。

長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直認(rèn)為薜荔與愛(ài)玉子的傳粉小蜂為同一種傳粉榕小蜂(Wiebesiapumilae(Hill))[6- 7]。1991年何坤耀從臺(tái)灣各地采集的愛(ài)玉子及薜荔的傳粉小蜂進(jìn)行研究，也認(rèn)為臺(tái)灣地區(qū)的薜荔與愛(ài)玉子共享一種傳粉小蜂，并且與香港的模式標(biāo)本無(wú)形態(tài)差異，同時(shí)，還觀察到在臺(tái)灣存在薜荔的雄株的地方，栽培愛(ài)玉子均能成功繁殖[8]。但近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明愛(ài)玉子傳粉小蜂與薜荔傳粉小蜂之間可能已經(jīng)發(fā)生了變異，例如，Chen 等發(fā)現(xiàn)福建愛(ài)玉子栽培園內(nèi)即使種植薜荔雄株(有傳粉小蜂)，卻不能使愛(ài)玉子結(jié)實(shí)，同時(shí)，薜荔、愛(ài)玉子繁殖生物學(xué)的調(diào)查表明，二者之間已經(jīng)存在生殖隔離[9]。江少華在臺(tái)灣高雄地區(qū)開(kāi)展的薜荔和愛(ài)玉子之間的人工輔助雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1)薜荔的傳粉小蜂可以進(jìn)入愛(ài)玉子的雌花期花序內(nèi)授粉并能結(jié)實(shí)，但無(wú)法進(jìn)入愛(ài)玉子雄花序；2)愛(ài)玉子傳粉小蜂可以進(jìn)入薜荔的雌花期花序內(nèi)授粉并能結(jié)實(shí)，也可以進(jìn)入雄花序產(chǎn)卵，但幼蟲(chóng)的死亡率高，小蜂發(fā)育與花序發(fā)育異步，導(dǎo)致羽化的小蜂無(wú)法出飛[10]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，有關(guān)榕小蜂的分子生物學(xué)研究越來(lái)越多，李和惠對(duì)兩個(gè)來(lái)自臺(tái)灣不同地區(qū)的薜荔傳粉小蜂和愛(ài)玉子傳粉小蜂進(jìn)行COI序列研究發(fā)現(xiàn)，兩者的遺傳距離為11.7%，認(rèn)為兩種小蜂已經(jīng)發(fā)生了很大的變異[4]。同時(shí)，陳艷對(duì)我國(guó)東南沿海及島嶼不同地理分布的薜荔榕小蜂進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，薜荔榕小蜂存在Sp.A、Sp.B、Sp.C3個(gè)隱存種[11]。以上證據(jù)表明，親緣關(guān)系密切的薜荔傳粉小蜂和愛(ài)玉子傳粉小蜂之間可能發(fā)生了遺傳分化。

由于薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂之間的形態(tài)差異極其細(xì)微，僅依賴(lài)傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記分類(lèi)方法，難以將它們區(qū)別開(kāi)來(lái)。薜荔傳粉小蜂和愛(ài)玉子傳粉小蜂究竟是同種？還是兩個(gè)不同的種？或是互為隱種關(guān)系？這一直是懸而未決的問(wèn)題。分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，給這一難題的解決帶來(lái)希望。本文用核糖體28SrDNAD1—D3，以及線(xiàn)粒體COI和 Cytb三種分子標(biāo)記對(duì)分類(lèi)地位模糊的薜荔和愛(ài)玉子傳粉小蜂進(jìn)行鑒定，明確薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂之間的分子遺傳關(guān)系，以期在愛(ài)玉子的經(jīng)濟(jì)栽培中起到指導(dǎo)性作用。

1 材料和方法

1.1 樣本的采集及保存

從2010年3月至2012年12月間于福建省福州市、莆田市等地采集實(shí)驗(yàn)小蜂，樣本及采集地點(diǎn)(表1)。將采集來(lái)的榕小蜂存放入含有無(wú)水乙醇保存液的1.5 mL的離心管中，使小蜂迅速死亡，置于-20 ℃保存。

表1 實(shí)驗(yàn)材料及采集地及其登陸號(hào)

愛(ài)玉子:F.pumilavar.awkeotsang；薜荔：F.pumilavar.pumila；黃葛樹(shù):F.virens；高榕：F.altissima; “-”表示無(wú)此樣本

1.2 基因組DNA的提取，PCR及測(cè)序

取95%的酒精-20 ℃下儲(chǔ)存的榕小蜂樣品，用酚氯仿抽提法進(jìn)行基因組DNA提取。用提取的基因組DNA進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增。

28S序列上游引物 28S-F：5′-ACCCGCTGAATTTAAGCATAT-3′

28S序列下游引物 28S-R：5′-TAGTTCACCATCTTTCGGGTC-3′

28S序列擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性60 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸70 s，34個(gè)循環(huán)后72℃延伸7 min結(jié)束，4 ℃保溫。

COI序列上游引物 COI-F：5′CAACATTTATTTTGATTTTTTGG3′

COI序列下游引物 COI-R：5′TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA3′

COI序列PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性60 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，34個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸7 min結(jié)束，4 ℃保溫。

Cytb序列上游引物 Cytb-F：5′TATGTACTACCATGAG GACAAATATC3′

Cytb序列下游引物 Cytb-R：5′ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT3′

Cytb序列擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min結(jié)束，4 ℃保溫。

對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，所有PCR產(chǎn)物均送至生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序所得序列上傳GenBank上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

得到測(cè)序序列后，在NCBI上用BLAST進(jìn)行相似性檢索，確定所得的序列確實(shí)為目的片段。將這些片段用CLUSTAL X 1.83進(jìn)行序列比對(duì)， BioEdit 3.3校正比對(duì)結(jié)果，截取相同長(zhǎng)度的序列進(jìn)行分析，運(yùn)用MEGA 4.0軟件計(jì)算不同序列的堿基組成及堿基替換，用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，計(jì)算K2P遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 榕小蜂核糖體28S序列分析

2.1.1 榕小蜂28S序列組成分析

對(duì)榕小蜂28S序列，用CLUSTAL X 1.83軟件進(jìn)行序列比對(duì)，截取對(duì)準(zhǔn)的941 pb序列進(jìn)行分析，用Mega4.0軟件中的Data explore軟件進(jìn)行各小蜂的堿基組成分析。在28S序列中，不變位點(diǎn)702個(gè)，變異位點(diǎn)233個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)91個(gè)，自裔位點(diǎn)140個(gè)，變異性為24.8%。各樣品的堿基組成分析見(jiàn)表2，由表2可知，所有的小蜂樣本堿基組成都比較平均，C+G的含量在55.7%—58.4%，C+G的含量略大于A+T的含量。

2.1.2 榕小蜂核糖體28S序列的遺傳距離分析

用Mega4.0軟件中的K2P法計(jì)算遺傳距離(表3)。所有樣品間的遺傳距離在0.0000—0.1503之間，愛(ài)玉子傳粉小蜂樣品間的遺傳距離為0.0000；薜荔傳粉小蜂樣品間遺傳距離為0.0017；兩群體間的平均遺傳距離為0.0043。

表2 榕小蜂28S序列的堿基組成

表3 基于Kimura雙參數(shù)模型榕小蜂28S序列的遺傳距離

2.1.3 榕小蜂核糖體28S序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站上對(duì)實(shí)驗(yàn)中的28S序列進(jìn)行同源性檢索，下載4種前人研究過(guò)的榕小蜂28S序列(表4)進(jìn)行分析。

表4 GenBank上下載的榕小蜂28S序列

圖1 鄰接法構(gòu)建的榕小蜂28S序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Fig.1 Phylogenetic tree reconstructed using NJ based on 28S sequence of fig wasps

用Mega4.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得與GenBank中下載的榕小蜂28S序列用NJ(Neighbor-joining)法，同時(shí)用重復(fù)抽樣1000次檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信值，建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。圖中顯示，相同屬的小蜂匯聚到一起，顯示出較近的親緣關(guān)系，愛(ài)玉子傳粉小蜂3個(gè)樣本和薜荔傳粉小蜂兩個(gè)樣本各自先匯聚成一支，再匯聚到一起，表明薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂群體之間已經(jīng)產(chǎn)生了一定的變異。圖中顯示每個(gè)屬的小蜂都能夠明顯的區(qū)分開(kāi)來(lái)，這說(shuō)明28S序列可以做為小蜂分子分類(lèi)的鑒定依據(jù)。

2.2 榕小蜂線(xiàn)粒體Cytb及COI序列分析

2.2.1 Cytb與COI序列堿基組成及變異分析

(1) Cytb序列組成及變異分析

對(duì)榕小蜂Cytb序列，用CLUSTAL X 1.83軟件進(jìn)行序列比對(duì)，截取對(duì)準(zhǔn)的376pb序列進(jìn)行分析，用Mega 4.0軟件中的Data explore軟件進(jìn)行各小蜂的堿基組成分析。在Cytb序列中，不變位點(diǎn)243個(gè)，變異位點(diǎn)132個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)73個(gè)，自裔位點(diǎn)59個(gè)，變異性為35.1%。A，T，G，C四種堿基的平均含量為32.9%，43.2%，9.7%，14.1%，A+T的平均含量為76.1%，顯著高于G+C的含量，符合膜翅目昆蟲(chóng)線(xiàn)粒體基因序列的共同特點(diǎn)。

Cytb密碼子不同位點(diǎn)的核苷酸頻率及堿基替換統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表5，表中可知，Cytb序列密碼子的各個(gè)位點(diǎn)上A+T含量均偏高，第三位點(diǎn)A+T的含量高達(dá)92.3%，A+T偏向尤為明顯，其中T的使用最為頻繁為54.3%。說(shuō)明Cytb基因在密碼子使用上具有偏向性。實(shí)驗(yàn)樣本中Cytb序列上核苷酸顛換數(shù)大于轉(zhuǎn)換數(shù)。密碼子第三位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換(si)和顛換(sv)發(fā)生的頻率明顯高于第一、二位點(diǎn)。

表5 Cytb密碼子不同位點(diǎn)的堿基頻率及堿基替換

(2) COI序列組成及變異分析

對(duì)榕小蜂COI序列，用CLUSTAL X 1.83軟件進(jìn)行序列比對(duì)，截取對(duì)準(zhǔn)的931pb序列進(jìn)行分析，用Mega4.0軟件中的Data explore軟件進(jìn)行各小蜂的堿基組成分析，在COI序列中，有不變位點(diǎn)641個(gè)，變異位點(diǎn)285個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)99個(gè)，自裔位點(diǎn)186個(gè)，總體變異性為14.2%，較Cytb序列總體變異性低。A，T，G，C四種堿基的平均含量為32.5%，39.4%，16.8%，11.2%，A+T的平均含量為71.9%，顯著高于G+C的含量，與Cytb序列一致符合膜翅目昆蟲(chóng)線(xiàn)粒體基因序列的共同特點(diǎn)。

COI密碼子不同位點(diǎn)的核苷酸頻率及堿基替換統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表6，表中可知，與Cytb序列相似COI序列密碼子的各個(gè)位點(diǎn)上A+T含量均偏高，第三位點(diǎn)A+T的含量為86.2%，A+T偏向最為明顯。說(shuō)明COI基因在密碼子使用上也具有偏向性。

表6 COI密碼子不同位點(diǎn)的堿基頻率及堿基替換

2.2.2 Cytb與COI序列遺傳距離分析

(1) Cytb序列的遺傳距離分析

運(yùn)用Mega 4.0軟件，基于K2p模型計(jì)算兩兩序列間的遺傳距離，對(duì)各樣品間遺傳距離的統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表7。試驗(yàn)小蜂群體核苷酸遺傳距離在0—0.3322之間，愛(ài)玉子傳粉小蜂個(gè)體間的遺傳距離為0.0164，薜荔傳粉榕小蜂個(gè)體間遺傳距離為0—0.0081，平均遺傳距離為0.0054。愛(ài)玉子與薜荔傳粉小蜂之間的遺傳距離為0.1369—0.1416，平均遺傳距離為0.1385。

表7 基于Kimura雙參數(shù)模型榕小蜂Cytb序列的遺傳距離

(2) COI序列的遺傳距離分析

運(yùn)用Mega 4.0軟件，基于K2P模型計(jì)算兩兩序列間的遺傳距離，對(duì)各樣品間遺傳距離的統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表8。試驗(yàn)小蜂群體COI序列核苷酸遺傳距離0.0038—0.8707在之間，愛(ài)玉子傳粉小蜂個(gè)體間的遺傳距離在0.0038—0.0153，平均遺傳距離為0.0102。薜荔傳粉榕小蜂各樣本間遺傳距離為0.0048。愛(ài)玉子與薜荔傳粉小蜂之間的遺傳距離為0.1854—0.1938，平均遺傳距離為0.1896。

表8 基于Kimura雙參數(shù)模型榕小蜂COI序列的遺傳距離

2.2.3 Cytb及COI序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立

實(shí)驗(yàn)所得序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast相似性檢索，下載得到8種有榕小蜂的Cytb序列5種COI序列(見(jiàn)表9)與實(shí)驗(yàn)所得序列一起建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2，圖3)，來(lái)分析小蜂之間的系統(tǒng)發(fā)育情況。

表9 GenBank上下載的榕小蜂Cytb與COI序列

用Mega4.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得與GenBank中下載的榕小蜂Cytb與COI序列用NJ(Neighbor-joining)法，同時(shí)用重復(fù)抽樣1000次檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信值，建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2、圖3。圖中顯示，樣本中屬于同一個(gè)屬的不同種的樣本匯聚到一起，顯示出較近的親緣關(guān)系。基于兩種序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)在薜荔與愛(ài)玉子小蜂上顯示出相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，愛(ài)玉子傳粉小蜂與薜荔傳粉小蜂個(gè)體先分別匯聚成一支然后兩群體再匯聚到一起，這顯示出兩群體之間親緣關(guān)系相對(duì)較近，同時(shí)產(chǎn)生了一定的變異。每個(gè)屬的小蜂都能夠明顯的區(qū)分開(kāi)來(lái)，這說(shuō)明Cytb與COI基因?yàn)殚判》滂b別的良好的分子標(biāo)記。

3 討論

3.1 3種分子標(biāo)記特征分析

很多學(xué)者認(rèn)為，如果用分子的手段進(jìn)行種類(lèi)鑒定時(shí)，不能只用某一個(gè)基因，因?yàn)橐粋€(gè)基因所含有的基因數(shù)量有限，只用一個(gè)基因來(lái)進(jìn)行種類(lèi)鑒定存在很大的風(fēng)險(xiǎn)。與用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法來(lái)進(jìn)行鑒定物種一樣，很少只用某一個(gè)特征來(lái)鑒定物種，因?yàn)檫@樣往往使鑒定的結(jié)果不夠準(zhǔn)確[12]。本研究用核糖體28S，線(xiàn)粒體Cytb及COI三個(gè)片段共同進(jìn)行研究，這樣就避免了一個(gè)基因片段含有的信息量有限而給研究帶來(lái)的誤差。對(duì)3種遺傳標(biāo)記序列分析結(jié)果表明，28S序列中4種堿基的含量較為平均，G+C堿基的平均含量為56%，比A+T的含量稍高，符合Campbell小蜂總科28SD2序列對(duì)小蜂總科及各科間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究時(shí)得出的28SD2序列G+C堿基的含量偏高的結(jié)論[13]。而Cytb與COI基因片段的堿基組成都一致的顯示出A+T含量明顯較高的特點(diǎn)，有研究顯示榕小蜂線(xiàn)粒體基因有A+T含量偏高的特點(diǎn)[11, 14]。并且Cytb及COI基因在密碼子的不同位點(diǎn)上顯示出了對(duì)堿基的不同偏好，特別是第三位點(diǎn)，Cytb基因密碼子的第三位點(diǎn)上A+T的含量高達(dá)92.7%，COI基因該位點(diǎn)A+T的平均含量為86.2%。這種偏好性產(chǎn)生的原因可能是因?yàn)槊艽a子第三位點(diǎn)產(chǎn)生的突變多為同義突變，發(fā)生該突變不會(huì)影響基因編碼的蛋白質(zhì)序列，對(duì)榕小蜂的影響較小，受到自然選擇的壓力較小，突變?nèi)菀妆槐Ａ粝聛?lái)[15- 16]。

圖2 鄰接法構(gòu)建的榕小蜂Cytb序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Fig.2 Phylogenetic tree reconstructed using NJ based on Cytb sequence of fig wasps

圖3 鄰接法構(gòu)建的榕小蜂COI序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Fig.3 Phylogenetic tree reconstructed using NJ based on COI sequence of fig wasps

3.2 3種分子標(biāo)記適用性分析

選擇合適的分子標(biāo)記，是用DNA序列進(jìn)行準(zhǔn)確分析的前提，不同的DNA序列在生物體中行使不同的功能，所承受的環(huán)境的選擇壓力不同，因而在序列的進(jìn)化速度上存在差異。對(duì)生物不同分類(lèi)階元進(jìn)行鑒定時(shí)，對(duì)所選擇的分子標(biāo)記的變異速度有不同的要求。在對(duì)亞種、種、屬等較低的分類(lèi)階元進(jìn)行研究時(shí)，要求所選擇的分析標(biāo)記要有較快的變異速度，這樣才能確保在親緣關(guān)系較近的不同個(gè)體之間存在足夠的變異能夠?qū)⑺鼈儏^(qū)別開(kāi)來(lái)。但是當(dāng)研究樣本之間是科、目等較高的分類(lèi)群體時(shí)，由于較高的分類(lèi)階元之間產(chǎn)生分化的時(shí)間比較久遠(yuǎn)，在不同的群體之間不僅在形態(tài)上往往存在較大的差異外，在分子水平上也已經(jīng)形成了穩(wěn)定而顯著的差異，因此在分析時(shí)要選擇進(jìn)化速度較慢，相對(duì)保守的分子標(biāo)記進(jìn)行分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)中3種序列進(jìn)行K2P遺傳距離分析顯示，28S序列小蜂群體的遺傳距離為0—0.1503，Cytb序列小蜂遺傳距離為0—0.3322，COI序列分析小蜂遺傳距離為0.0038—0.8707，這說(shuō)明Cytb與COI基因進(jìn)化速度較快，而28S序列相對(duì)比較保守。有研究認(rèn)為28S片段非常保守，更適合高級(jí)階元(屬、亞科)系統(tǒng)發(fā)育的研究[13, 17]。薜荔傳粉榕小蜂與愛(ài)玉子傳粉榕小蜂之間的親緣關(guān)系很近，甚至被認(rèn)為是同一個(gè)種，所以用進(jìn)化速度相對(duì)較快的Cytb及COI序列對(duì)兩者進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析較為妥當(dāng)。

3.3 薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂分子遺傳關(guān)系確定

對(duì)一些動(dòng)物的 Cytb基因序列分析表明，種內(nèi)個(gè)體間的差異一般在0%—4.06%，當(dāng)個(gè)體差異超過(guò)6%時(shí)就說(shuō)明個(gè)體間已有亞種或種的分化[18- 19]。Xiao等研究顯示榕小蜂Cytb基因序列種間差異一般在11%—22%之間[20]，本實(shí)驗(yàn)中愛(ài)玉子傳粉小蜂個(gè)體間的Cytb遺傳距離為0.0164，薜荔傳粉榕小蜂個(gè)體間Cytb序列平均遺傳距離為0.0054；愛(ài)玉子傳粉小蜂與薜荔傳粉小蜂群體之間的Cytb序列遺傳距離為0.1385，兩群體間的遺傳距離明顯大于群體內(nèi)部各樣本之間的遺傳距離，表明薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂之間的變異已達(dá)到了種間分化的水平。

Herbert利用COI序列對(duì)鱗翅目分屬5個(gè)科的200個(gè)近緣種昆蟲(chóng)進(jìn)行K2P遺傳距離的研究顯示，其種內(nèi)平均差異僅為0.25%，屬內(nèi)種間差異在5.8%—9.1%之間，種間平均差異為6.8%[21]。目前關(guān)于榕小蜂種間、種內(nèi)差異的標(biāo)準(zhǔn)還比較少，姜自鋒(2005)利用COI基因開(kāi)展榕小蜂分子系統(tǒng)學(xué)研究時(shí)，將遺傳距離3%的差異水平作為區(qū)分種間和種內(nèi)關(guān)系的界限[22]。李艷偉對(duì)189種榕小蜂進(jìn)行COI序列分析顯示，約123個(gè)種(65%)的種內(nèi)差異小于2%，32個(gè)種(17%)的種內(nèi)差異在2%—5%之間，即共有155個(gè)種(82%)的種內(nèi)差異小于5%；約132個(gè)種(70%)的種間差異在10%—15%之間，有32個(gè)種(17%)的種間差異大于20%[12]。Zhou等在對(duì)Philotrypesis小蜂進(jìn)行分子鑒定時(shí)，顯示榕小蜂的COI序列差異達(dá)到5.8%—6.0%時(shí)可以鑒定成不同的種[23]。本實(shí)驗(yàn)中薜荔傳粉榕小蜂個(gè)體間COI序列遺傳距離為0.0048，愛(ài)玉子傳粉小蜂各樣本間COI序列平均遺傳距離為0.0102；愛(ài)玉子傳粉小蜂與薜荔傳粉小蜂群體間COI序列平均遺傳距離為0.1896，兩榕小蜂群體間的遺傳距離明顯大于群體內(nèi)部各樣本之間的遺傳距離，實(shí)驗(yàn)中所研究的愛(ài)玉子傳粉小蜂與薜荔傳粉小蜂之間已經(jīng)發(fā)生了很大的分化，其變異水平已經(jīng)達(dá)到了種的分異水平。

綜上所述，基于28S，Cytb及COI序列所得的結(jié)果顯示，福建地區(qū)的薜荔傳粉小蜂和愛(ài)玉子傳粉小蜂各自群體內(nèi)部的遺傳距離都很小，沒(méi)有隱存種的分化，Cytb與COI序列分析結(jié)果一致表明二者群體之間的遺傳距離達(dá)到了種間分異的水平，加之Chen等人研究顯示福建地區(qū)的薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂之間已存在生殖隔離[9]，因此薜荔傳粉小蜂與愛(ài)玉子傳粉小蜂可以被認(rèn)為是兩個(gè)不同的種。

致謝：感謝福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心陳騏教授對(duì)寫(xiě)作的幫助。

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ThemoleculargeneticrelationshipbetweenthepollinatorsofFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsang

WU Wenshan, CHEN Youling*, SUN Lingli, MAO Jianping, YANG Wenxin, WANG Aifang

ProvincialKeyLaboratoryforDevelopmentalBiologyandNeurosciences，CollegeofLifeScience,FujianNormalUniversity,Fuzhou350117,China

Ficuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsangare two varieties of the same species (Moraceae); one is the original variant while the other is a later variant and, they have long been considered to interact with the same species of pollinator. However, the recent studies in morphology, ecology and pollination biology suggest that a differentiation between the pollinators ofFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsangwasps may have occurred during the evolution. In the present studies, we used three molecular markers including 28SrDNA D1—D3, the mitochondrial Cytb and COI genes to investigate the genetic relationship of these two pollinators. The pollinator samples were collected fromFicuspumilavar.pumilaat three different locations as well as three cultivars ofFicuspumilavar.awkeotsang. The data are summarized as follows: (1) The distribution of the four bases including A, T, G, C in the 28SrDNA sequence from the pollinators ofFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsangis relatively akin. The average content of C + G (56%) is slightly higher than the average content of A+T (44%). The average content of A+T in the mitochondrial Cytb sequence is 76.1%, significantly higher than the average content of C+G (23.9%). The COI sequence analysis shows a similar result, with the A+T content (71.9%), higher than the G+C content (28.1%). This base composition pattern is consistent cross along hymenopteran mitochondrial sequences. Furthermore, in the Cytb and COI sequences, it appears to have the highest content of A/T base at the third position of a codon. (2) The 28SrDNA sequence evolution appears to be slower than the Cytb and COI gene sequences, is relatively conservative, and maybe more suitable for senior-order (family or subfamily) phylogenetic studies. In contrast, the Cytb and COI molecular markers may be more suitable for the genetic relationship analyses between the pollinators ofFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsangdue to their close ties. (3) The results derived from genetic distance analyses show that the average distance of the Cytb sequence of each sample withinFicuspumilaL.pumilapollinator or withinFicuspumilavar.awkeotsangpollinator is 0.0054 or 0.0164. The average genetic distance of the Cytb sequence between the two pollinator groups is 0.1385. The average genetic distance of the COI sequence of each sample withinFicuspumilavar.pumilaorFicuspumilavar.awkeotsangis 0.0048 or 0.0102, while the average genetic distance between the two wasp populations is 0.1896. Since the genetic distance between the two wasp groups are significantly greater than the genetic distance within the respective group, these data suggest that the two groups of fig wasps have differentiated during the evolution and reached to the level of species identification, namely the pollinators ofFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsangare the two different wasp species.

Ficuspumilavar.pumila;Ficuspumilavar.awkeotsang; fig wasps; COI; Cytb; 28S

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31270440)；福建省科技廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2011N0014)；福建省高等學(xué)校學(xué)科帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目；福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物學(xué)拔尖生培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目

2013- 06- 09;

2013- 07- 25

*通訊作者Corresponding author.E-mail: chenyouling2000@126.com

10.5846/stxb201306091500

吳文珊,陳友鈴,孫伶俐,毛建萍,楊問(wèn)新,王愛(ài)芳.基于28S, COI和Cytb基因序列的薜荔和愛(ài)玉子傳粉小蜂分子遺傳關(guān)系研究.生態(tài)學(xué)報(bào),2013,33(19):6049- 6057.

Wu W S, Chen Y L, Sun L L, Mao J P, Yang W X, Wang A F.The molecular genetic relationship between the pollinators ofFicuspumilavar.pumilaandFicuspumilavar.awkeotsang.Acta Ecologica Sinica,2013,33(19):6049- 6057.