林如輝 ，李鉆芳 ，胡海霞 ，朱曉勤 ，毛敬潔 ，劉 嬌 ，張 蘊 ，陳立典

（1.福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州350122；4.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

最近研究顯示：在中國大城市腦血管病是第三位死亡原因，而在農(nóng)村女性中為首位死亡原因，在男性中則為第二位［1］。缺血性腦卒中居中醫(yī)四大頑證（風、癆、臌、膈）之首，為中西醫(yī)重點研究的疾病之一，該病最核心的問題是神經(jīng)系統(tǒng)損害引起的神經(jīng)功能障礙，其主要表現(xiàn)在語言、運動、思維及情緒等方面［2-4］。有研究表明針刺督脈、陽明經(jīng)等穴，能夠改善腦卒中后的認知功能障礙。課題組前期實驗［5］從NF-kB信號通路探討針刺MCAO大鼠神庭、百會后蛋白的變化，結(jié)果表明經(jīng)電針刺激后大鼠腦內(nèi)NF-kBp65、p-IkB 表達水平下降，而 IkB、Bax、Fas水平上升，與模型組比較明顯抑制了NF-kB的活性，從而起到抑制神經(jīng)元凋亡的作用，證明了針刺神庭、百會可以通過NF-kB信號通路改善大鼠認知功能障礙的作用機制。本文擬在前期實驗基礎(chǔ)上觀察電針MCAO大鼠神庭、百會后的腦超微結(jié)構(gòu)變化情況，以進一步闡明針刺神庭、百會后改善MCAO大鼠認知功能障礙的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重（260＋20）g，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供［許可證號：SYXK（閩）2005—004］。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用隨機數(shù)字表法將大鼠編號。

1.2 儀器 H-7650透射電鏡（日本Hitach公司）；電鏡CCD相機-圖像采集分析系統(tǒng)（德國Soft-Imaging-System公司）；UC-6超薄切片機（德國Leica公司）。

1.3 方法

1.3.1 造模 依據(jù)文獻［6］，術(shù)前所有實驗動物禁食12 h。大鼠稱重后，以腹腔注射水合氯醛3 mL／kg麻醉。分離并暴露左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈及其深部分支翼腭動脈。依次結(jié)扎頸總動脈近心端、頸外動脈遠心端，并于頸總動脈分叉處近心端預留結(jié)扎線。用微動脈夾夾閉翼腭動脈及遠端頸內(nèi)動脈。距頸總動脈分叉處1.0 mm處用顯微剪刀剪一切口，將備好的線栓插入頸內(nèi)動脈，插入長度約18.0～22.0 mm至大腦前動脈近端，完全阻斷大腦中動脈血供?？`緊預先放置于頸總動脈的結(jié)扎線，頸部傷口常規(guī)縫合。2 h后，輕柔回抽線栓至頸總動脈分叉處。術(shù)中和術(shù)后保持室溫25℃左右，用白熾燈照射動物，使其肛溫維持在（37±1）℃，直到恢復活動。假手術(shù)組只分離動脈，不結(jié)扎、插線。手術(shù)結(jié)束后，動物置于室溫（25℃）環(huán)境下蘇醒，正常飲食。

1.3.2 實驗分組及干預 ①假手術(shù)組：置于普通籠中飼養(yǎng)，只給予同等條件抓取，不給予任何治療；②模型組：造模后回籠飼養(yǎng)，只給予同等條件抓取，不給予任何治療；③ 針刺組：參考《實驗針灸學》取大鼠神庭和百會穴，應(yīng)用GM101電針儀，電壓峰值6V，以針體輕輕抖動為度，疏密波，頻率1～20 Hz。每次30 min，每天1次，共7 d。手術(shù)后2 h開始治療，直至第7天動物被處死。各組10只。

1.3.3 電鏡制樣及觀察 依據(jù)文獻［7］，按實驗要求將大鼠麻醉，開胸，生理鹽水200 mL經(jīng)左心室快速沖洗，4%多聚甲醛（pH＝7.4）400 mL灌流固定。取腦后置入4%多聚甲醛內(nèi) 4℃ 固定24～48 h，經(jīng)3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定24 h，1%鋨酸后固定 2 h，0.1 mol／L 磷酸鹽緩沖液（pH7.2）充分浸洗；50%～100%酒精-丙酮梯度脫水，每次15 min；半浸透 37℃ 1.5 h，純浸透 37℃ 3 h，包埋后在37℃、45℃、60℃分別聚合12、40、48 h。超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色。透射電鏡下觀察切片，先在低倍下全面觀察，再詳細觀察細胞的外形、細胞核及細胞器。

2 結(jié) 果

2.1 針刺干預MCAO大鼠腦神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察見圖1。電鏡觀察假手術(shù)組：神經(jīng)元細胞大多呈長橢圓形，膜完整，表面突起較多；核大，呈圓形或橢圓形，表面核孔豐富，染色質(zhì)分布均勻，異染色質(zhì)無邊聚；細胞內(nèi)線粒體豐富，截面呈長圓形或圓形，線粒體嵴未見斷裂或溶解；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，表明核糖體豐富，無明顯脫落或擴張；高爾基復合體偶見，糖原豐富?；蛞娸S突，軸突內(nèi)見豐富的線粒體嵴微絲微管。見豐富的樹突，細胞內(nèi)有豐富的突觸，突觸前膜及后膜內(nèi)豐富小泡，突觸間隙清晰（圖1A）。模型組神經(jīng)元呈圓形或不規(guī)則形，表面突起少、有些細胞膜破裂；細胞核大而圓，染色質(zhì)分布較分散，有些細胞核內(nèi)染色質(zhì)部分邊聚、核孔變大甚至核膜破裂；線粒體體積變大，線粒體嵴斷裂或消失甚至呈空泡化；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，有些擴張成池狀，脫顆?，F(xiàn)象嚴重；糖原分散，偶可見溶酶體。軸突樹突變小，軸突內(nèi)線粒體空泡樣變，微絲微管不連續(xù)或變稀疏，突觸結(jié)構(gòu)分離 （圖1B）。針刺組神經(jīng)元細胞近圓形或近橢圓形，膜相對完整，表明有突起；細胞核圓形，染色質(zhì)分布相對均勻，少見異染色質(zhì)邊聚；細胞內(nèi)線粒體較多，體積大小不均，部分線粒體內(nèi)嵴稀疏，部分斷裂，偶見空泡樣變；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見明顯擴張，糖原較多。軸突少，軸突內(nèi)線粒體空泡樣變不明顯，微絲微管可見，突觸偶見（圖1C）。

圖13組大鼠腦神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)圖（×15000）

2.2 針刺刺激神庭、百會后腦血管超微結(jié)構(gòu)觀察見圖2。假手術(shù)組血管基膜完整且較厚，血管內(nèi)突起較多，偶見內(nèi)皮細胞核及紅細胞，胞飲小泡較多，內(nèi)皮細胞之間的連接偶見，可見內(nèi)皮細胞內(nèi)線粒體，血管與周圍的腦組織連接緊密，無腫脹及分離（圖2A）。模型組腦內(nèi)血管基膜變薄，血管內(nèi)皮光滑，少見內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮細胞核，血管與周圍腦組織分離，空泡化變明顯（圖2B）。針刺組血管基膜相對較厚，內(nèi)皮細胞可見，可見細胞核，血管與周圍腦組織連接相對較好，無明顯腫脹（圖2C）。

圖23組大鼠腦血管的超微結(jié)構(gòu)圖（×15000）

3 討 論

應(yīng)用百會、風府、人中、大椎、神庭等督脈腧穴治療中風病，可起到開竅啟閉，健腦寧神的作用。百會穴屬督脈，統(tǒng)督諸陽，又與任脈相通，故百會能治諸陽經(jīng)之疾。神庭也屬督脈，為督脈、足太陽、陽明之會，神者，天部之氣也，庭者，庭院也，聚散之所也。神庭可寧神醒腦、降逆平喘，對于神智方面的疾病，非神庭不能治。

針刺刺激神庭、百會穴后超微結(jié)構(gòu)變化明顯，假手術(shù)組神經(jīng)元細胞大多正常，血管正常，無明顯變化。當造模后神經(jīng)元細胞水腫明顯，血管與周圍組織分離，細胞空泡化變明顯，電子密度明顯降低，在形態(tài)學上說明MCAO大鼠造模成功。大鼠大腦缺血缺氧后炎性細胞浸潤，血管通透性改變，腦組織迅速進入凋亡或液化壞死樣變，進而引起一系列功能障礙。本實驗表明：針刺神庭、百會后神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)保持相對較完整，血管水腫程度減輕，血腦屏障滲透性減少，從而減輕腦組織的水腫。腦組織水腫減輕后，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的功能得以部分恢復，所以能在一定程度上改善缺血再灌注后的認知功能障礙，這為針刺神庭、百會改善缺血再灌注后認知功能障礙的作用機制提供客觀的依據(jù)。

［致謝：本實驗在國家中醫(yī)藥管理局三級（細胞結(jié)構(gòu)與功能）實驗室各位老師幫助下順利完成，在此表示真誠的謝意!］

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部.2012年中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒［M］.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2012：52-53.

［2］NYENHUIS D L，GORELICK P B，GEENEN E J，et al.The pattern of neuropsychological deficits in Vascular Cognitive Impairment-No Dementia （Vascular CIND）［J］.Clin Neuropsychol，2004，18（1）：41-49.

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