袁 玲，李建華

(湖北工程學(xué)院 特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 孝感 432000)

桑椹原花青素提取的響應(yīng)曲面優(yōu)化分析

袁 玲，李建華

(湖北工程學(xué)院 特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 孝感 432000)

以桑椹原花青素的提取率為指標(biāo)，利用中心組合設(shè)計(jì)(central composite design,CCD)優(yōu)化桑椹原花青素超聲提取工藝。結(jié)果表明，建立的三次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型是合適模型，優(yōu)化提取工藝參數(shù)為：超聲功率315W，液料比60:1(mL/g)，提取時(shí)間12min。在該條件下桑椹原花青素的最優(yōu)提取值是496.29 μg/g。經(jīng)驗(yàn)證，所得工藝參數(shù)準(zhǔn)確，可指導(dǎo)桑椹原花青素的提取生產(chǎn)。

桑椹；原花青素；響應(yīng)曲面分析；超聲波；提取工藝

桑椹(Mulberry)為多年生木本植物桑(MorusalbaL.)的成熟漿果。桑椹不僅營養(yǎng)價(jià)值高，而且還含有礦物質(zhì)、氨基酸、維生素、黃酮、多酚等多種豐富的藥用成分，具有抗腫瘤、抗病毒、治療心腦血管疾病等作用[1]，被衛(wèi)生部認(rèn)定為“既是藥品，又是食品”的資源。桑椹的藥用成分及生物學(xué)活性越來越引起國內(nèi)外學(xué)者的興趣。

原花青素(Procyanidins，PC)是一類聚多酚化合物的總稱，人體內(nèi)不能合成，是一種良好的氧自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑，是迄今人類發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)、最有效的自由基清除劑之一[2]。具有抗氧化、抗生物突變等活性[3]，有很好的保健效果[4]。原花青素易溶于溫度50℃以上熱水及濃度為30%的乙醇[5]。已有少量以桑椹或桑椹果酒酒糟為原料，有機(jī)溶劑提取桑椹原花青素的工藝研究報(bào)道[6-7]。本文采用超聲水提法，對桑椹中的原花青素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為桑椹原花青素的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料與試劑

試驗(yàn)用桑椹采自湖北省孝感市朋興鄉(xiāng)，45℃烘干，粉碎過50目篩備用。原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)。所用試劑正丁醇、硫酸鐵銨、濃鹽酸、甲醇、無水乙醇均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Cary 60紫外可見分光光度計(jì)(安捷倫科技(中國)有限公司)；DL-480B智能超聲波清潔器(上海之信儀器有限公司)；SHZ-III循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；PL203電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)； HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.3方法

1.3.1 確定檢測波長

準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為0.50mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取0.3mL于10mL具塞比色管中，加入甲醇溶液至1.0mL，然后加入6.0mL正丁醇-鹽酸溶液(體積比為95∶5)和0.2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的硫酸鐵銨溶液(臨用時(shí)配制)，搖勻后，置沸水浴中加熱40min，然后迅速冷卻[8]，在波長400～700nm處進(jìn)行掃描，確定其最大吸收波長。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取質(zhì)量濃度為0.50mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL置于6支10mL具塞比色管中，各加入甲醇溶液至1.0mL，分別配成0，50，100，150，200，250mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述優(yōu)化的條件下，測定其吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用Design-Expert軟件中的中心組合設(shè)計(jì)(Central Composite Design ，CCD)模塊中的二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了一組3因素5水平的共計(jì)20次的實(shí)驗(yàn)(full CCD 設(shè)計(jì))，其中析因部分實(shí)驗(yàn)次數(shù)為14次，星點(diǎn)數(shù)為5，保證均一精密性的中心點(diǎn)重復(fù)次數(shù)手動調(diào)整為6，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平見表1。

表1 中心組合設(shè)計(jì)因素水平表

1.3.4 桑椹原花青素的提取與測定

準(zhǔn)確稱取1.00 g干粉末，按照中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)中設(shè)置的不同提取條件，分別進(jìn)行浸提、離心、抽濾，收集各個(gè)提取條件下得到的提取液以備用。各提取液按1.3.1中方法處理后，測定吸光值，計(jì)算樣品中原花青素的含量。

1.3.5 驗(yàn)證與提取次數(shù)確定

在最優(yōu)條件下提取桑椹原花青素并與預(yù)測結(jié)果進(jìn)行比較(設(shè)置4個(gè)重復(fù))，以確定優(yōu)化模型預(yù)測的準(zhǔn)確性；將第一次提取過濾所得的桑椹殘?jiān)赐瑯拥臈l件再提取一次，以確定所需提取次數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

用Cary 60紫外可見分光光度計(jì)分析系統(tǒng)自帶軟件繪制波長檢定曲線，用Excel軟件擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸及方差分析[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1原花青素檢測波長的確定

將處理好的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液倒入直徑為1cm的石英比色皿中，在Cary 60紫外可見分光光度計(jì)中從400nm到700nm進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果如圖1所示。

圖1 原花青素波峰檢測

從圖1可以看出，原花青素在可見光區(qū)有一明顯的吸收峰，波峰所在波長為550nm，因此鐵鹽催化比色法測定原花青素含量的檢測波長為550nm。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

以原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得到原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。 Excel軟件計(jì)算得到回歸方程為y=0.0022x-0.0076，決定系數(shù)R2=0.9974，表明該回歸方程比較可靠。

2.3試驗(yàn)結(jié)果

以超聲波功率、料液比、提取時(shí)間三個(gè)因素為自變量，20次試驗(yàn)得到桑椹原花青素提取量(R)如表2所示。

2.4模型的建立與方差分析

利用Design-Expert軟件對試驗(yàn)結(jié)果(表2)進(jìn)行回歸及方差分析[10](分析結(jié)果見表3)，發(fā)現(xiàn)本研究符合三次方模型，經(jīng)過響應(yīng)曲面法的擬合計(jì)算得出該模型的決定系數(shù)R-Squared為0.9506，表明該模型具有較高的可信度；校正系數(shù)RAdj=0.8826 ，表明在原花青素含量總的變異中，有88.26%是由獨(dú)立變量引起的。失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型能夠?qū)ιｉ┰ㄇ嗨氐奶崛∵M(jìn)行預(yù)測和分析。

表2 響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

以超聲波功率、料液比、提取時(shí)間三個(gè)因素作為自變量，分別以A、B、C表示，原花青素提取量(R)為因變量， 即響應(yīng)值，得優(yōu)化的回歸方程為：R=541.27-1.97A-1.46B-7.06C+0.03AB+0.06AC+0.34BC+2.10A2-0.03B2-0.55C2-1.45ABC+0.01C3。R的物理意義是每克干桑椹提取原花青素的微克數(shù)。方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小直接反應(yīng)了各因素對響應(yīng)值的影響程度。系數(shù)的正負(fù)反應(yīng)了影響的方向。由回歸方程可知，料液比的線性項(xiàng)及功率、料液比的二次項(xiàng)對原花青素的提取率影響顯著。

表3 三次多項(xiàng)式模型方差分析表

2.5參數(shù)優(yōu)化、驗(yàn)證與提取次數(shù)

在Design Expert 8.0軟件的優(yōu)化(optimization)模塊中，將優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為最大值800，求解得R的最優(yōu)值是496.29μg/g，預(yù)測的最佳實(shí)驗(yàn)條件為：超聲功率315W，液料比60:1(mL/g)，提取時(shí)間12min。為檢驗(yàn)優(yōu)化條件的準(zhǔn)確性，按照上述優(yōu)化得到的工藝參數(shù)，重復(fù)進(jìn)行4次試驗(yàn)，得其平均值為505.52μg/g，與預(yù)測值相差1.86%，表明實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值基本吻合。

在最優(yōu)提取條件下連續(xù)提取2次，發(fā)現(xiàn)桑椹原花青素第一次提取率可達(dá)84.6%，表明在此工藝條件下，桑椹原花青素的一次提取成功率較高。

3 結(jié)論

本研究以桑椹原花青素提取量為響應(yīng)值，通過多元擬合方程，獲得了桑椹原花青素提取工藝中各影響因子的最佳提取參數(shù)。以水為溶劑，在超聲波功率為315W，液料比60:1，提取12min的工藝條件下，可從1g 烘干桑椹中提取原花青素496.29μg。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，本文設(shè)計(jì)的工藝條件穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值相差1.86%，基本吻合；在此工藝條件下，桑椹原花青素的一次提取率較高。而且，本工藝條件無污染、操作簡便，提取率高，在桑椹原花青素提取實(shí)踐中具有較高的參考價(jià)值。

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(責(zé)任編輯：張凱兵)

OptimizationofExtractionProcessofProcyanidinfromMulberrybyResponseSurfaceMethodology

Yuan Ling，Li Jianhua

(HubeiKeyLaboratoryofQualityControlofCharacteristicFruitsandVegetables,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China)

Using extraction rate as an indicator, the central composite design model was used to design an ultrasonic extraction technology of procyanidins from mulberry. Result showed that the cubic mathematical model was the optimal one and the optimum extraction parameters were as the following：ultrasonic power 315 W, liquid solid ration 60:1 (mL/g), extraction time 12 min, and the predicted extraction rate of procyanidins was 496.29 μg/g on the same conditions. It was verified that the processing parameters in this experiment were accurate and could be applied in the mass extraction of procyanidins from mulberry.

mulberry; procyanidins; response surface analysis; ultrasonic wave; extraction technology

TS202.3

A

2095-4824(2013)06-0060-04

2013-08-30

生物質(zhì)廢棄物轉(zhuǎn)化利用湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心(SWZ010)

袁 玲(1970- )，女，湖北孝感人，湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授。

李建華(1969- )，男，湖北孝感人，湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院教授，理學(xué)博士。