張治強(qiáng)，成蘭英

(西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng)621010)

苦瓜(Momordica charantiaL.)是葫蘆科苦瓜屬植物，具有消暑滌熱，明目解毒之功效［1］?？喙戏N子中含有豐富的蛋白質(zhì)。目前，人們已經(jīng)從中提取純化出多種活性蛋白質(zhì)［2-5］，并對(duì)其氨基酸組成和藥理活性進(jìn)行檢測(cè)［6-9］?？喙献阎械牡鞍踪|(zhì)具有多種活性，如苦瓜凝集素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞有抑制作用［10］，核糖體失活蛋白具有抗HIV和抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用［11-13］。此外，人們發(fā)現(xiàn)多種具有N-糖苷酶活性的蛋白質(zhì)如苦瓜凝集素(MCL)［14］、胰蛋白酶抑制劑(MCTI-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)［15-17］、核糖體失活蛋白(RIP)［18］和多肽-P［19］等。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，苦瓜籽蛋白質(zhì)還具有一定的抗菌活性［5］。由于苦瓜蛋白質(zhì)中大部分為清蛋白(49.3%)、球蛋白(29.3%)和谷蛋白(3.1%)［20］，采用蛋白質(zhì)常用鹽溶提取法，NaCl濃度、鹽溶液p H對(duì)苦瓜籽蛋白質(zhì)的提取率具有較大影響。本研究采用紫外光譜法和微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上利用Box-Benhnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，研究NaCl鹽溶液濃度、溶液p H和提取時(shí)間對(duì)苦瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響，確定三種因素的主次關(guān)系、交互影響和最佳組合，旨在提高苦瓜籽蛋白質(zhì)的提取產(chǎn)率，為苦瓜籽蛋白質(zhì)的綜合開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)利用提供指導(dǎo)和幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦瓜籽 購(gòu)自四川省綿陽(yáng)市華靈高科良種繁育研究中心;NaCl、HCl、NaOH、無(wú)水乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250 成都科龍化工試劑廠;牛血清蛋白(BSA)上海伯奧生物科技有限公司;所用試劑均為分析純。

KDN-102C型凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;pHS-3C p H酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司;UV-2102型紫外分光光度計(jì) 尼科上海儀器有限公司;AL104型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;GL-20LX-B型高速冷凍離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司;LHS-250SC型恒溫恒濕箱 上海一恒科技有限公司;EYELA water bath SB-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理 將苦瓜籽用高速組織搗碎機(jī)粉碎，用石油醚(固液比1∶3，g/mL)浸泡一周脫脂，減壓蒸餾回收石油醚。將脫脂苦瓜籽粉末置于通風(fēng)廚中以揮發(fā)溶劑，冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 苦瓜籽蛋白質(zhì)的提取方法 參照Lee-Huang等［18］方法，取2g脫脂苦瓜籽粉末，用12mL 0.15mol/L的NaCl溶液抽提5min，再用1mol/L的HCl調(diào)p H至3.6，4℃下緩慢攪拌15min，用紗布過(guò)濾殘?jiān)瑸V液于10000r/min下離心15min，即得蛋白質(zhì)溶液。

1.2.3 苦瓜籽蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 苦瓜籽蛋白質(zhì)總含量的測(cè)定采用微量凱氏定氮法，參照GB 5009.5-2010。

苦瓜籽提取液蛋白質(zhì)的含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:分別取1mg/mL牛血清蛋白50、100、150、200、250、300μL 于試管中，加入 5mL 考馬斯亮藍(lán)溶液，再用蒸餾水補(bǔ)足至6mL，5min后測(cè)其吸光度值，建立回歸方程為Y=0.0023X+0.58573，Y為吸光度值，X為蛋白質(zhì)含量(μg)，結(jié)果顯示，吸光度值在0.701～1.271之間具有良好的線性關(guān)系(R2=0.99947)，單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)所得吸光度值均在此區(qū)間內(nèi)。提取液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法:取1mL不同實(shí)驗(yàn)條件下的苦瓜籽蛋白質(zhì)溶液定容至50mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作，在595nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算蛋白質(zhì)的含量，以蛋白質(zhì)提取率高低評(píng)價(jià)提取效果。苦瓜籽蛋白質(zhì)提取率公式:

苦瓜籽蛋白質(zhì)的提取率(%)=提取液中蛋白質(zhì)含量/原料中蛋白質(zhì)總含量×100

1.2.4 苦瓜籽蛋白質(zhì)的單因素實(shí)驗(yàn) 選定NaCl濃度、pH、提取時(shí)間三個(gè)因素作單因素實(shí)驗(yàn)，考察各因素對(duì)蛋白質(zhì)提取效果的影響。

1.2.5 苦瓜籽蛋白質(zhì)提取的響應(yīng)面設(shè)計(jì) 在單因素的基礎(chǔ)上，采用SAS 9.1.3中的Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，每個(gè)組合重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。轉(zhuǎn)換公式X1=(x1-1.0)/0.2，X2=x2-8，X3=x3-4。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平與編碼Table 1 Code and level of factors chosen for the trials

2 結(jié)果與討論

2.1 凱氏定氮法測(cè)定苦瓜籽蛋白質(zhì)總含量

3次測(cè)定結(jié)果表明苦瓜籽中蛋白質(zhì)平均含量為32.13%。

2.2 苦瓜籽蛋白質(zhì)提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 NaCl濃度對(duì)提取效果的影響 取2g苦瓜籽，分別加入12mL 濃度分別為 0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mol/L的NaCl溶液進(jìn)行提取，溶液 pH7，4℃下提取12h，結(jié)果如圖1。

圖1 NaCl濃度對(duì)苦瓜籽蛋白提取的影響Fig.1 Effect of concentration of NaCl on the extraction of bitter melon protein

當(dāng)NaCl溶液濃度由0.4～1.0mol/L增加時(shí)，蛋白質(zhì)提取率呈上升趨勢(shì)，但濃度達(dá)到1.0mol/L后，提取率變化不大，趨于穩(wěn)定。由于低濃度的鹽溶液能夠增加蛋白質(zhì)分子表面的電荷，增加其水中溶解度，而高濃度的鹽溶液反而會(huì)破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜和電荷，出于保護(hù)蛋白質(zhì)活性的需要，本實(shí)驗(yàn)選擇1.0mol/L。

2.2.2 溶液pH對(duì)提取效果的影響 取2g苦瓜籽，加入12mL 濃度為1.0mol/L、pH 分別為 6、7、8、9、10、11的NaCl溶液進(jìn)行提取，4℃下提取12h，結(jié)果如圖2。

圖2 pH對(duì)苦瓜籽蛋白提取的影響Fig.2 Effect of pH on the extraction of bitter melon protein

當(dāng)溶液pH為8時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最大，因?yàn)閴A性條件下蛋白質(zhì)發(fā)生酸式解離，使其本身帶相同的負(fù)電荷而相互排斥，增加其在水溶液中的分散性，同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)的次級(jí)鍵氫鍵有一定的破壞作用，對(duì)蛋白質(zhì)有一定的增溶作用。當(dāng)溶液pH為10時(shí)，溶液的p H與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相等，蛋白質(zhì)分子的靜電荷為零，相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒(méi)有靜電排斥力而聚集沉淀，蛋白質(zhì)的溶解度最低，當(dāng)溶液pH大于10后，蛋白質(zhì)分子攜帶同種電荷而相互排斥，阻止了單分子的聚集［21］，因此溶解度增大，濃度增加，提取率升高，但是過(guò)堿環(huán)境破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，使部分埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的羧基、酚羥基和巰基離子化［22］，影響其生物活性，所以選擇pH為8。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響 取2g苦瓜籽，加入12mL 1.0mol/L、p H7的NaCl溶液，4℃下分別提取 0.5、1、2、4、6、8、12h，結(jié)果如圖 3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)苦瓜籽蛋白提取的影響Fig.3 Effect of time on the extraction of bitter melon protein

在0.5～4h內(nèi)，提取率隨提取時(shí)間的增加而變大，當(dāng)提取時(shí)間為4h時(shí)，蛋白質(zhì)具有最大的溶出率，提取效果最好，4h后提取效果下降，濃度降低，說(shuō)明蛋白質(zhì)已經(jīng)開(kāi)始部分水解。由于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的精氨酸與芳香族氨基酸能夠進(jìn)一步與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合［23］，使得8h后溶液顏色加深，吸光度值增加，導(dǎo)致提取率升高，因此為了防止蛋白質(zhì)水解，保持其原有活性，提取時(shí)間選擇4h。

2.3 鹽溶法提取蛋白質(zhì)工藝的優(yōu)化

2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以NaCl濃度、pH、提取時(shí)間為自變量，蛋白質(zhì)提取率Y為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，其中1～12為析因?qū)嶒?yàn)，13～15為中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS 9.1.3，以NaCl濃度、pH、提取時(shí)間為響應(yīng)變量，以苦瓜籽蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到回歸方程方差分析表3。

采用SAS軟件對(duì)響應(yīng)值和各因素進(jìn)行回歸擬合，得方程:

Y=23.69333+0.6525X1-0.64625X2-0.10125X3- 1.321667X2+ 0.2725X X- 0.0225X X+112130.180833X22-0.73X2X3-0.864167X32

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental designs and results

由表3可以看出，模型的p=0.000183＜0.01，模型達(dá)到極顯著。在各因素交互作用中，X1和X3交互影響不顯著，X1和X2之間交互作用顯著，X2和X3之間極顯著，說(shuō)明它們各自兩因素之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，還存在二次關(guān)系。

模型失擬項(xiàng)p＞0.05，不顯著，表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值誤差較小，可以用此模型預(yù)測(cè)真實(shí)值。模型的絕對(duì)系數(shù)R2=0.9900，說(shuō)明該模型能解釋99.00%的響應(yīng)值變化，即吸光度的變化99.00%來(lái)自NaCl濃度、pH和提取時(shí)間，因此該模型擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，與實(shí)際情況較吻合，可以用此模型對(duì)鹽溶法提取蛋白的效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

各因素的影響程度分析，模型中的因素X1、X2、X12、X2X3和 X32達(dá)到極顯著水平(p＜0.01)，X3(提取時(shí)間)影響不顯著。由F檢驗(yàn)得到各因子貢獻(xiàn)率為X1＞X2＞X3，即NaCl濃度 ＞pH ＞提取時(shí)間。

表3 回歸模型的方差和顯著性分析結(jié)果Table 3 Coefficient and significance of regression model

2.3.3 鹽溶法提取蛋白工藝的響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面圖，如圖4～圖6。

由圖4可知，隨著因素X1的取值不斷增大，響應(yīng)值不斷增大，在中心點(diǎn)過(guò)后小幅度下降，波動(dòng)不大。在X1的作用下，隨著因素X2編碼值的增大，響應(yīng)面的值不斷減小。由圖5可以看出，隨著X1和X3的數(shù)值的增大，響應(yīng)面的值都是先增大后減小，在X1和X2的中心點(diǎn)附近吸光度有最大值，此時(shí)蛋白質(zhì)具有較大的溶出率。由圖6可知，固定NaCl濃度，當(dāng)提取時(shí)間和p H都在中心點(diǎn)附近時(shí)，蛋白質(zhì)提取率較高，有利于蛋白質(zhì)的溶出。由以上響應(yīng)面圖分析可知，在各因素中心點(diǎn)附近，溶液的環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響較小，此時(shí)蛋白質(zhì)具有較高的溶出率，回歸方程具有最優(yōu)水平。

圖4 蛋白質(zhì)提取率與NaCl濃度、pH的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface contour plots showing effects of concentration of NaCl and pH on the protein extraction rate

圖5 蛋白質(zhì)提取率與NaCl濃度、提取時(shí)間的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface contour plots showing effects of concentration of NaCl and extraction time on the protein extraction rate

圖6 蛋白質(zhì)提取率與pH、提取時(shí)間的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface contour plots showing effects of pH and extraction time on the protein extraction rate

2.3.4 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證 將回歸方程對(duì)X1、X2、X3分別取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，解方程組帶入轉(zhuǎn)化公式，得最優(yōu)提取條件為NaCl濃度1.33mol/L、p H為 8.76、提取時(shí)間為 3.62h，理論提取率為23.57%。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整為NaCl濃度1.3mol/L、p H為8.8、提取時(shí)間為3.6h，在此最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，吸光度平均值為 1.172，提取率為23.80%，誤差為0.98%，響應(yīng)值的實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測(cè)值吻合良好，因此響應(yīng)面法對(duì)苦瓜籽蛋白質(zhì)提取條件的優(yōu)化是可行的，模型方程適合。將優(yōu)化前后的提取工藝和結(jié)果進(jìn)行整理分析得表4。

表4 優(yōu)化前后提取工藝的比較Table 4 Comparison of abstraction process before and after optimization

按照原方法［18］提取的蛋白質(zhì)溶液吸光度為0.724，提取率為5.61%，優(yōu)化后蛋白質(zhì)提取率為23.80%，較之前提高了3.24倍。說(shuō)明優(yōu)化后各因素能夠更明顯利于蛋白質(zhì)的溶解，大大提高蛋白質(zhì)的提取率。

3 結(jié)論

本研究利用SAS軟件，通過(guò)響應(yīng)面法確定鹽溶法提取苦瓜籽蛋白質(zhì)的最佳提取工藝為:NaCl濃度1.3mol/L、pH 為 8.8、提取時(shí)間為 3.6h，產(chǎn)率為23.80%。通過(guò)方差分析得知，三個(gè)因素對(duì)苦瓜籽蛋白質(zhì)提取的影響大小為:NaCl濃度＞pH＞提取時(shí)間。通過(guò)凱氏定氮法確定苦瓜籽中蛋白質(zhì)含量為32.13%。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上冊(cè))［M］.上海:上海科技出版社，1986:1281.

［2］Xiong S D，Yu K，Liu X H，et al.Ribosome-inactivating proteins isolated from dietary bitter melon induce apoptosis and inhibit histone deacetylase-1 selectively in premalignant and malignant prostate cancer cells［J］.International Journal of Cancer，International Journal of Cancer，2009，125(4):774-782.

［3］Huang L，Adachi T，Shimizu Y，et al.Characterization of lectin isolated from Momordica charantia seed as a B cell activator［J］.Immunology letters，2008，121(2):148-156.

［4］Parkash A，Ng TB，Tso WW.Purification and characterization of charantin，a napin-like ribosome-inactivating peptide from bitter gourd(Momordica charantia)seeds［J］.The Journal of Peptide Research:Official Journal of the American Peptide Society，2002，59(5):197-202.

［5］蔡馬，于群，朱新產(chǎn).苦瓜籽蛋白的PEG/(NH4)2SO4雙水相分離及抑菌作用的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2011，23(4):612-619.

［6］R Horax，N Hettiarachchy，A Kannan，et al.Proximate composition and amino acid and mineral contents of Mormordica charantia L.pericarp and seeds at different maturity stages［J］.Food Chemistry，2010，122(4):1111-1115.

［7］Fang EF，Zhang CZ，Wong JH，et al.The MAP30 protein from bitter gourd(Momordica charantia)seeds promotes apoptosis in liver cancer cells in vitro and in vivo［J］.Cancer letters，2012，324(1):66-74.

［8］Fang E F，Zhang C Z，Zhang L，et al.In vitro and in vivo anticarcinogenic effects of RNase MC2，a ribonuclease isolated from dietary bitter gourd，toward human liver cancer cells［J］.The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2012，44(8):1351-1360.

［9］郎海濱，糜漫天，程天民，等.苦瓜核糖體失活蛋白的純化及其誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的研究［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2004，26(2):139-143.

［10］Fang E F，Zhang C Z，Ng T B，et al.Momordica Charantia lectin，a type II ribosome inactivating protein，exhibits antitumor activity toward human nasopharyngeal carcinoma cells In Vitro and In Vivo［J］.Cancer Prevention Research(Philadelphia，Pa.)，2012，5(1):109-121.

［11］Jiratchariyakul W，Wiwat C，Vongsakul M，et al.HIV Inhibitor from Thai bitter gourd［J］.Planta Medica，2001，67(4):350-353.

［12］樊劍鳴，馬建新，高德富，等.苦瓜蛋白MAP30對(duì)大腸癌細(xì)胞株LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，44(5):983-985.

［13］Li M，Chen Y，Liu Z，et al.Anti-tumor activity and immunological modification of ribosome-inactivating protein(RIP)from Momordica Charantia by covalent attachment of polyethylene glycol［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2009，41(9):792-799.

［14］Ng T B，Wong C M，Li W W，et al.Isolation and characterization of a galactose binding lectin with insulinomimetic activities.From the seeds of the bitter gourd Momordica charantia(Family Cucurbitaceae)［J］.International Journal of Peptide and Protein Research，1986，28(2):163-172.

［15］Hara S，Makino J，Ikenaka T.Amino acid sequences and disulfide bridges of serine Proteinase inhibitors from bitter gourd(Momordica charantia Linn)seeds［J］.Journal of Biochemistry，1989，105(1):88-92.

［16］Hamato N，Koshiba T，Pham TN，et al.Trypsin and elastase inhibitors from bitter gourd(Momordica charantia Linn)seeds:purification，amino acid sequences，and inhibitory activities of four new inhibitors［J］.Journal of Biochemistry，1995，117(2):432-437.

［17］Huang B，Ng TB，F(xiàn)ong WP，et al.Isolation of a trypsin inhibitor with deletion of N-terminal pentapeptide from the seeds of Momordica cochinchinensis，the Chinese drug mubiezhi［J］.The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，1999，31(6):707-715.

［18］Lee-Huang S，Huang PL，Nara PL，et al.MAP30:a new inhibitor of HIV-1 infection replication［J］.FEBS Letters，1990，272(1-2):12-18.

［19］Khanna P，Jain SC，Panagariya A，et al.Hypoglycemic activity of polypeptide-p from a plant source［J］.Journal of Natural Products，1981，44(6):648-655.

［20］Horax R，Hettiarachchy N，Over K，et al.Extraction，F(xiàn)ractionation and Characterization of Bitter Melon Seed Proteins［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(3):1892-1897.

［21］王鏡巖.生物化學(xué)(上冊(cè))［M］.北京:高等教育出版社，2002:305.

［22］周瑞寶.植物蛋白功能原理與工藝［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007:30.

［23］張建社.蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)［M］.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2009:93.