李念念，周光宏，徐幸蓮，劉登勇，李春保

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095)

苯并芘又稱3，4-苯并芘，簡稱Bap，是一種含5個(gè)環(huán)的稠環(huán)芳烴，是由一個(gè)苯環(huán)和一個(gè)芘分子結(jié)合而成的多環(huán)芳烴類化合物，是多環(huán)芳烴類化合物(PAHs)的代表，具有多種同分異構(gòu)體，廣泛存在于各種食品中［1］。目前，已發(fā)現(xiàn)的400多種致癌物中，1/2以上屬于多環(huán)芳烴類化合物，其中，苯并芘是致畸、致突變和致癌性物質(zhì)的代表［2］。小劑量苯并芘就有可能引起局部組織的癌變，也可引起大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA、肺細(xì)胞及肝細(xì)胞損傷［3-5］。目前，由食品污染所導(dǎo)致的疾病已成為全世界最為廣泛關(guān)注的食品安全問題之一，許多國家已將Bap列為食品有害物質(zhì)監(jiān)測的重要內(nèi)容之一，德國已對肉制品中Bap的殘留制定了限量標(biāo)準(zhǔn)1μg/kg，歐盟規(guī)定煙熏劑中 Bap 的含量不超過 0.03μg/kg［6］，我國國標(biāo)限定糧食和肉制品中Bap的殘留量應(yīng)在5μg/kg以下，植物油中為 10μg/kg［7］。目前，國內(nèi)外已報(bào)道大氣［8］、肉類食品［9-12］、反應(yīng)香精［13］、茶葉［14］、水產(chǎn)品［15］、植物油［16］、土壤［17］中苯并芘的檢測方法有熒光分光光度法［18］、薄層層析法［19］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［20］和高效液相色譜法［9-16］。其中，高效液相色譜法具有高效、快速、靈敏度高和檢出率高的優(yōu)點(diǎn)，且易推廣，是目前使用最廣泛的方法，但此法通常需要固相萃取小柱對樣品進(jìn)行凈化，固相萃取存在操作繁瑣、成本高、耗時(shí)等缺點(diǎn)，樣品多時(shí)無法滿足檢測的要求。因此，本實(shí)驗(yàn)在參考有關(guān)文獻(xiàn)［9-11，13-16］的基礎(chǔ)上，簡化了苯并芘的提取過程，建立了一種適用于檢測臘肉中苯并芘含量的快速、準(zhǔn)確的檢測方法，為食品安全檢測提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品(純度 ＞99%) 美國Sigma公司;甲醇 德國Meker公司，色譜純;正己烷 美國Fisher公司，色譜純;KOH、Na2S·9H2O 上海試劑有限公司，分析純;臘肉 超市購買。

MDL9000(B)-H-30型臺式實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)南京總馨純水設(shè)備公司;Waters Alliance 2695高效液相色譜系統(tǒng)、Waters2475熒光檢測器、Waters X BridgeTMC18柱(4.6mm ×250mm，5μm) 美國 Waters公司;SHIMADZU微量分析天平 日本島津公司;氮吹儀 上海安普有限公司;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司;0.22μm有機(jī)濾膜。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 準(zhǔn)確稱取苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置于100mL棕色容量瓶中，甲醇定容，該儲(chǔ)備液(A液)濃度為100μg/mL，避光，放置在4℃冰箱中保存。吸取A液1.00mL于100mL棕色容量瓶中，甲醇定容，該儲(chǔ)備液(B液)濃度為1μg/mL，避光，放置在4℃冰箱中保存。

1.2.2 工作曲線溶液的配制 精密吸取定量B液于100mL容量瓶中，甲醇定容，配成質(zhì)量濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾后，置于樣品瓶中，4℃冰箱保存待用。

1.2.3 液相色譜分析條件 色譜條件如下:色譜柱:Waters X BridgeTMC18(4.6mm ×250mm，5μm);流動(dòng)相∶V(甲醇)∶V(水)=90∶10;熒光檢測器:激發(fā)波長(λex):365nm，發(fā)射波長 (λem):410nm;流速:1mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.4 樣品的提取 用電子天平準(zhǔn)確稱取用絞肉機(jī)絞碎混勻的樣品5g于150mL具塞錐形瓶中，加入30mL 2mol/L KOH(甲醇∶水 =9∶1，V/V)溶液和 2g Na2S·9H2O，塞緊瓶塞，置于70℃恒溫水浴鍋內(nèi)2.5h;取出錐形瓶趁熱加入30mL正己烷，再超聲提取30min;加入30mL水充分振蕩，然后在黑暗中靜置放置直到正己烷相和水相分層。取上層正己烷相15mL經(jīng)氮吹儀吹干，準(zhǔn)確加入1.00mL甲醇，超聲溶解后，經(jīng)0.22μm的微孔有機(jī)濾膜過濾，供高效液相色譜測定。

1.2.5 結(jié)果的計(jì)算 采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間對樣品進(jìn)行定性;定量方法是根據(jù)苯并芘標(biāo)準(zhǔn)液的濃度和色譜峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣品測定時(shí)苯并芘的色譜峰面積在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出相應(yīng)的提取液中苯并芘的濃度，再經(jīng)換算即可得到臘肉中苯并芘的含量，換算公式為

式中:X為樣品中苯并芘含量，μg/kg;C為待測溶液中苯并芘的質(zhì)量濃度，μg/mL;V為樣品濃縮體積(V=1mL);F為正己烷總體積是經(jīng)過氮吹的正己烷體積的倍數(shù)(F=2);m為稱樣質(zhì)量，kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)主要從流動(dòng)相的組成、流速、檢測器條件、進(jìn)樣量等幾個(gè)方面來進(jìn)行色譜條件的選擇。比較了幾種流動(dòng)相，分別為甲醇∶水(70∶30)、甲醇∶水(80∶20)、甲醇∶水(90∶10)，發(fā)現(xiàn)甲醇∶水(90∶10)條件下，苯并芘和樣品中干擾物能達(dá)到較好基線分離;在0.6～2.0mL/min范圍內(nèi)改變流動(dòng)相流速，發(fā)現(xiàn)在流速為1.0mL/min苯并芘出峰時(shí)間合適，峰形較好;對苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液用熒光光譜儀進(jìn)行掃描，固定激發(fā)波長，其發(fā)射波長為410nm處有最大吸收峰;再固定發(fā)射波長，其激發(fā)波長為365nm處有最大吸收峰;進(jìn)樣量大可提高測定的靈敏度，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到10μL以上時(shí)，峰形將發(fā)生分散、拖尾等現(xiàn)象。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)確定測定的色譜條件為:流動(dòng)相為甲醇∶水(90∶10)，流速 1.0mL/min，柱溫 35℃，激發(fā)波長(λex)為365nm，發(fā)射波長(λem)為410nm，進(jìn)樣量為10μL，以Waters X BridgeTMC18反相色譜柱作為分離柱，所得苯并芘色譜峰形對稱，基線平穩(wěn)，目標(biāo)峰和其它雜質(zhì)峰達(dá)到完全分離，測定結(jié)果令人滿意。此條件下苯并芘的保留時(shí)間為11.44min，標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖見圖1、圖2。

圖1 苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 The chromatograms of benzo(a)pyrene in standard sample

圖2 樣品中苯并(a)芘的色譜圖Fig.2 The chromatograms of benzo(a)pyrene in sample

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

由于肉制品成分復(fù)雜，目前國內(nèi)外普遍采用固相萃取的方法對樣品進(jìn)行凈化。但固相萃取小柱價(jià)格昂貴、操作繁瑣、提取過程不穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了肉制品中苯并芘的提取方法。先采用皂化的方法除去脂肪，再利用苯并芘易溶于正己烷的性質(zhì)，經(jīng)正己烷結(jié)合超聲處理提取苯并芘，最后用水洗去其他水溶性雜質(zhì)。取空白基質(zhì)(豬肉)各6份，分別加入低(0.005μg/mL)、中(0.02μg/mL)、高(0.05μg/mL)三種不同濃度的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.4的方法對樣品進(jìn)行提取，同時(shí)進(jìn)行直接測定和過固相萃取柱后測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。由表1可以看出，過固相萃取柱的回收率低于不過柱的回收率，兩種處理方法的測定結(jié)果之間無顯著性差異(p＞0.05)，因此采用不過固相萃取小柱的方法進(jìn)行提取。

表3 不同品牌臘肉中苯并芘的含量Table 3 Contents of Bap in preserved ham of different brands

表1 不同凈化方法提取苯并芘的回收率(n=6)Table 1 Recovery of the different method to purifying(n=6)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

取1.2.2節(jié)質(zhì)量濃度0.002～0.5μg/mL的苯并芘系列標(biāo)準(zhǔn)溶液依次從低濃度到高濃度進(jìn)樣，按2.1節(jié)確定的色譜條件進(jìn)行測定，每個(gè)濃度進(jìn)行平行測定三次，得出峰面積的平均值，以質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)，回歸方程為Y=4×108X-662420，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。表明在0.002～0.5μg/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，符合定量要求。

圖3 苯并芘標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of Bap

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)及方法的檢出限

對質(zhì)量濃度為0.01μg/mL的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，所得峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.85%，表明該方法具有良好的精密度。

方法的檢出限(LOD)定義為產(chǎn)生3倍信噪比(S/N=3)的化合物的質(zhì)量濃度，以產(chǎn)生10倍信噪比(S/N=10)的化合物的質(zhì)量濃度作為定量限(LOQ)，選一系列較低濃度的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1的液相色譜條件進(jìn)行測定，信噪比S/N=3時(shí)，苯并芘的檢出限為0.15μg/kg;信噪比S/N=10時(shí)，苯并芘的定量限為0.5μg/kg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法的靈敏度較高，能滿足對苯并芘檢測和污染控制的要求。

2.5 樣品的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取5g臘肉樣品，分別加入0.01μg/mL的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、2.5、5mL，然后按照1.2.4的方法進(jìn)行提取，按照2.1的色譜條件進(jìn)行測定計(jì)算加標(biāo)回收率，測定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，加標(biāo)平均回收率在85.14%～91.01%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.96%～5.37%之間，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，能夠滿足臘肉中苯并芘含量的檢測要求。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 Results of spike recovery test(n=6)

2.6 實(shí)際樣品中苯并芘的測定

從超市里購買了8個(gè)品牌的臘肉，按照1.2.4的方法進(jìn)行提取，按照2.1的色譜條件進(jìn)行測定，每個(gè)樣品取三份，每份平行測定3次，取平均值，所測樣品中苯并芘的含量結(jié)果見表3。利用所建立的方法對市售臘肉中苯并芘含量進(jìn)行了分析，8種臘肉中均存在著一定量的苯并芘，檢測出的總量在0.98～8.89μg/kg之間。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜法檢測臘肉中的苯并芘色譜條件為:以Waters X BridgeTMC18反相色譜柱作為分離柱，流動(dòng)相為甲醇∶水(90∶10)，流速1.0mL/min，柱溫35℃，熒光檢測器激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為410nm，進(jìn)樣量為10μL，苯并芘的保留時(shí)間為11.44min。該方法的線性范圍、檢出限、回收率和精密度均可滿足實(shí)際樣品檢測的要求。利用所建立的方法對市售臘肉中苯并芘含量進(jìn)行了分析，8種臘肉中均存在著一定量的苯并芘，檢測出的總量為0.98～8.89μg/kg之間。本方法對樣品的前處理簡單快速，方法實(shí)用、準(zhǔn)確，特別適合樣品量較多的實(shí)驗(yàn)，可為今后臘肉中苯并芘研究工作的深入展開提供有力的技術(shù)支持。

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