鄭秋玲，聶少平，李文娟，胡曉娟，謝明勇

染料木素(genistein，Gen)，又稱為金雀異黃酮、染料木黃銅，是異黃酮的主要成分，其性質(zhì)穩(wěn)定，且毒副作用小，是一種已被廣泛認(rèn)知的、最為常見的且活性最為顯著的植物雌激素之一［1］。其結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)源性雌激素相似，并可競爭與雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合，從而能夠發(fā)揮抗雌激素作用以及類雌激素作用［2］。近年來，因植物雌激素毒副作用小，且食源含量高，越來越引起人們的關(guān)注與重視。研究證實(shí)，植物雌激素具有抗癌、抗氧化、抑制骨質(zhì)疏松等積極治療作用［3－5］。流行病學(xué)調(diào)查研究表明，東方國家因其飲食習(xí)慣中豆類食物豐富，其乳腺癌、前列腺癌以及心血管疾病等患病率明顯低于西方國家［6］。在人們大力提倡攝入植物雌激素的同時(shí)，有關(guān)植物雌激素安全性的問題也逐漸引起了大家的重視。然而，因各地區(qū)種族差異性以及各研究團(tuán)隊(duì)研究方法的不一致性，其結(jié)果一直具有爭議性。

宮頸癌是全球婦女中僅次于乳腺癌的惡性腫瘤，是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，且發(fā)病率有持續(xù)上升的趨勢［7］。然而，有關(guān)宮頸癌的研究卻較少，遠(yuǎn)不及對(duì)乳腺癌的研究。研究表明，宮頸癌發(fā)生、發(fā)展與體內(nèi)雌激素水平密切相關(guān)［8］，但具體作用機(jī)制及與食源性植物雌激素的關(guān)系不詳。本實(shí)驗(yàn)試圖探討染料木素對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，以期為染料木素對(duì)宮頸癌的影響及作用機(jī)制提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)以及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及試劑 人宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)，購買自美國ATCC;Gen，純度99%以上，溶于DMSO，配制成母液、雌二醇(E2)，美國Sigma公司;兔抗人ERα，美國Abcam公司;活性炭處理過的胎牛血清(CDT-FBS)，美國Hyclone公司;DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司;四甲基偶氮唑藍(lán)溶液(MTT)，中國索萊寶公司;細(xì)胞周期檢測試劑盒，中國碧云天公司;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，中國凱基生物公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 流式細(xì)胞儀，美國BD公司;3K15-高速冷凍離心機(jī)，美國Sigma公司;凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，中國深圳國華電器有限公司;METTLER TOLEDO AL104電子天平，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;垂直電泳儀，美國Bio-Rad公司;CO2培養(yǎng)箱、E-330酶標(biāo)儀，美國Thermo公司;超凈工作臺(tái)，中國吳江市凈化設(shè)備總廠;倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 貼壁生長HeLa細(xì)胞用無酚紅含10%CDT-FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞狀態(tài)良好，傳代或進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。傳代時(shí)棄原培養(yǎng)液，以PBS洗滌1－2次，然后加入0.25%胰酶消化細(xì)胞，離心(1 000 r·min－1，5 min)，加入新培養(yǎng)液重懸，接種于新培養(yǎng)瓶。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 MTT檢測，對(duì)照組:等體積的DMSO(體積含量比為0.1%);雌二醇陽性對(duì)照組(E2):0.01 μmol·L－1E2;Gen 組:0.001、0.01、0.1、1、10 μmol·L－1染料木素處理細(xì)胞。藥物刺激48、72 h后檢測。細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡檢測的分組同上，藥物刺激48 h后檢測。Western blot檢測ERα表達(dá)，對(duì)照組:等體積的DMSO(體積含量比為0.1%);Gen 組:用 0.1 μmol·L－1Gen 刺激 HeLa細(xì)胞 3、6、12、24 h。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞生長 用傳代的方法將細(xì)胞制成1×107·L－1的細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，每孔200 μl，置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加藥，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48、96 h后，每孔加入20 μl的 MTT(5 g·L－1)，繼續(xù)孵育4 h 后取出96孔板，將液體棄凈，每孔加入150 μl DMSO溶液，振蕩10 min后檢測其在490 nm處的吸光值，計(jì)算平均OD值及增殖率(PR):PR/%=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化 用0.25%的胰酶消化、收集細(xì)胞，制成5×108·L－1濃度的細(xì)胞懸液，接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h后加藥，加藥48 h后收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，每次1 000 r·min－1離心5 min。棄上清，加入PBS混勻細(xì)胞，再加入無水乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為0.75，固定24 h(4℃)后棄去固定液，PBS洗滌細(xì)胞后加入100 μl RNase，水浴37℃孵育30 min，最后加入 400 μl Propidium Iodide(PI)染液，水浴37℃孵育30 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期變化。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集HeLa細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱孵育24 h后加藥，48 h后收集細(xì)胞。用PBS洗滌兩次，每次離心 5 min(1 000 r·min－1)。加入 500 μl緩沖液懸浮細(xì)胞，加入 Annexin V-FITC、PI各 5 μl，混勻，室溫、避光反應(yīng)5 min，1 h內(nèi)檢測細(xì)胞凋亡變化。

1.2.6 Western blot方法檢測ERα蛋白表達(dá) 根據(jù)MTT檢測細(xì)胞生長的數(shù)據(jù)，采用對(duì)HeLa細(xì)胞增殖作用較為明顯的染料木素濃度(0.1 μmol·L－1)刺激HeLa細(xì)胞，分別作用3、6、12及24 h后收集細(xì)胞，提取核蛋白。根據(jù)目標(biāo)蛋白分子(ERα蛋白和β-actin)量配制10%SDS-PAGE凝膠，根據(jù)蛋白濃度，調(diào)整上樣量一致后進(jìn)行電泳。常規(guī)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，牛血清白蛋白(BSA)37℃封閉1 h。ERα抗體按1∶1 000稀釋，于4℃過夜，洗脫后二抗孵育，輕搖1 h，洗脫后ECL顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)成像檢測分析(以β-actin作為內(nèi)參)。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的一般特性 在倒置顯微鏡下觀察，HeLa細(xì)胞貼壁生長，排列緊密，細(xì)胞體積較大，細(xì)胞為梭形或扁平多邊形，邊界清晰，胞質(zhì)豐富。見Fig 1。

Fig 1 Features of HeLa cells

2.2 MTT結(jié)果 Gen對(duì)HeLa細(xì)胞生長的作用如Fig 2所示。實(shí)驗(yàn)濃度的 Gen(0.001～10 μmol·L－1)均促進(jìn)了HeLa細(xì)胞的生長，且隨著作用時(shí)間的增加作用效果更加明顯。濃度為0.1 μmol·L－1的Gen作用72 h后增殖效果最明顯，OD值為(1.992±0.055)，與對(duì)照組的(1.247±0.086)相比，差異具有顯著性(P＜0.05)，且增殖作用大于陽性對(duì)照組E2組(OD值=1.827±0.034)。

2.3 染料木素對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響 由流式檢測結(jié)果Fig 3可知，在Gen的作用下，HeLa細(xì)胞S期細(xì)胞比例有所增加，G1期比例降低，并且在0.01 μmol·L－1的Gen的作用下，細(xì)胞周期的變化最明顯，S期比例由(24.68±4.38)%增加到(38.84±3.80)%，其效果較E2更為明顯。見Tab 1。

2.4 染料木素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)Gen刺激48 h后，HeLa細(xì)胞凋亡率明顯下降。與對(duì)照組相比(凋亡率為24.37±0.78)，Gen在0.1 μmol·L－1濃度下作用效果最為明顯(凋亡率為8.77±1.23)，其效果較E2更為明顯(凋亡率為11.29±2.92)。見Tab 2。

Fig 2 Effect of Gen on proliferation of HeLa cells

Fig 3 Effect of Gen on cell cycle of HeLa cells

Tab 1 Effect of Gen on cell cycle of HeLa cells

Tab 2 Effect of Gen on apoptosis of HeLa cells

2.5 染料木素對(duì)HeLa細(xì)胞ERα表達(dá)的影響 研究表明，雌激素可通過調(diào)節(jié)雌激素受體，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖［9］。因此，本研究進(jìn)一步檢測Gen對(duì)雌激素受體ERα的影響。如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，Gen刺激6 h后，HeLa細(xì)胞中ERα表達(dá)量明顯上調(diào)，在24 h后與對(duì)照組差異無顯著性。

Fig 4 Effect of Gen on ERα expression in HeLa cells

3 討論

目前，研究顯示植物雌激素對(duì)宮頸癌的增殖具有抑制作用［10］，但多是研究其在高濃度下(一般大于10 μmol·L－1)的作用。然而，攝入的食源性植物雌激素的濃度是否能達(dá)到該濃度仍有待考察，且因不同地區(qū)飲食習(xí)慣的不同，攝入的植物雌激素濃度高低不同。因此，除考察其高濃度作用效果外，探討植物雌激素在低濃度下對(duì)宮頸癌增殖作用的影響具有重要的意義。研究表明，植物雌激素在低濃度下能夠發(fā)揮類雌激素作用［11］，因此，本實(shí)驗(yàn)以人宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用低劑量植物雌激素Gen，選取內(nèi)源性雌激素E2作為陽性對(duì)照，考察Gen對(duì)宮頸癌的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)濃度的染料木素(0.001 ～10 μmol·L－1)都能夠?qū)eLa細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用，該作用結(jié)果與E2相一致。

眾所周知，為保持細(xì)胞的正常運(yùn)行，細(xì)胞內(nèi)部有著精密的調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞周期是生命活動(dòng)中的一個(gè)非常重要的過程，具有非常復(fù)雜和精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制及過程，對(duì)它的研究是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的一個(gè)重要內(nèi)容。細(xì)胞周期分為間期和有絲分裂期，細(xì)胞間期又分為休眠期(G0)、DNA合成前期(G1)、DNA合成期(S)以及DNA合成后期(G2)。下一階段的開始依賴于前一階段的完成，而各個(gè)階段之間的銜接依賴于很多調(diào)控因子。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期發(fā)生紊亂從而導(dǎo)致細(xì)胞失控性生長有關(guān)［12］。用Gen刺激HeLa細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞比例有所增加，G1期細(xì)胞比例有所下降，表明Gen可能通過對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控從而達(dá)到促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖的作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在外界環(huán)境的影響下為了更好的適應(yīng)環(huán)境在一系列基因的調(diào)控下主動(dòng)有序死亡的過程，凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有著密切的關(guān)系［13］。本實(shí)驗(yàn)中，與細(xì)胞周期的Gen作用時(shí)間相對(duì)應(yīng)，用Gen作用HeLa細(xì)胞48 h后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)各組的凋亡率均明顯降低，表明Gen也可能通過對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制進(jìn)而影響細(xì)胞增殖。

ERα是被廣泛認(rèn)知的一種雌激素受體，廣泛分布于人體各組織中，能夠與內(nèi)源性及外源性雌激素表現(xiàn)出相似的結(jié)合特性。在無雌激素存在的情況下，ERα以抑制性復(fù)合體形式存在，而雌激素與ERα結(jié)合后則能夠與靶基因上的雌激素反應(yīng)元件結(jié)合，激活靶基因，在無雌激素反應(yīng)元件基因的細(xì)胞中，ERα也能夠通過調(diào)節(jié)一些轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，ER在體內(nèi)參與的信號(hào)通路復(fù)雜，對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)依賴于不同的細(xì)胞類型。在一些生殖器官癌細(xì)胞中如乳腺癌MCF-7細(xì)胞以及卵巢癌細(xì)胞中都檢測到了ERα的高表達(dá)［14］，因此，對(duì)宮頸癌細(xì)胞中ERα的表達(dá)及其作用的研究有著至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在宮頸癌細(xì)胞中也同樣發(fā)現(xiàn)了ERα高表達(dá)的現(xiàn)象。

綜上所述，Gen可能通過上調(diào)ERα的表達(dá)量，激活一系列調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)，從而促進(jìn)了HeLa細(xì)胞的增殖。然而，Gen在細(xì)胞內(nèi)參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其相互間的作用方式仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究。

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