彭 菊，劉 偉，羅超華，陳小輝，張文清，莫志賢

斑馬魚(Danio rerio，zebrafish)，是一種常見的熱帶觀賞魚，因其體側(cè)具有像斑馬一樣縱向的暗藍(lán)與銀色相間的條紋而得名。其具有體積小，產(chǎn)卵量大，胚胎繁殖迅速且整體透明，易于活體觀察［1］等特點(diǎn)，作為一種新的模式生物越來(lái)越多的應(yīng)用于各種人類疾病模型的建立以及藥物的高通量篩選。與大鼠、小鼠等哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚給藥量少且給藥方式簡(jiǎn)單;與果蠅等低等動(dòng)物相比，斑馬魚基因圖譜與人類有極大的相似;與細(xì)胞模型相比，斑馬魚擁有整體生物優(yōu)勢(shì)以及能夠進(jìn)行靶向給藥的特點(diǎn)［2－3］。利用它的眾多優(yōu)點(diǎn)，斑馬魚作為一種新型模式生物在行為學(xué)上的應(yīng)用前景也逐漸被研究者所認(rèn)識(shí)，利用斑馬魚進(jìn)行藥物依賴研究的報(bào)道也逐漸出現(xiàn)［1，4］。

目前，國(guó)外利用斑馬魚進(jìn)行藥物依賴的研究主要集中在研究斑馬魚對(duì)成癮藥物產(chǎn)生的學(xué)習(xí)記憶［5］、成癮藥物誘導(dǎo)的位置偏愛［6－8］、成癮藥物戒斷癥狀研究［8－9］、成癮藥物引起的斑馬魚腦內(nèi)蛋白表達(dá)的改變以及相關(guān)的行為學(xué)變化［9－10］等幾個(gè)方面。國(guó)內(nèi)也陸續(xù)開始了對(duì)斑馬魚藥物依賴機(jī)制的研究［4，11］。本研究利用條件性位置偏愛(conditioned place preference，CPP)原理并結(jié)合斑馬魚的生物學(xué)特性，旨在建立斑馬魚的嗎啡依賴模型，為進(jìn)一步研究藥物依賴的戒斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 鹽酸嗎啡，解放軍總后勤部藥品供應(yīng)站提供，批號(hào):710303。魚用生理鹽水，自配，NaCl濃度為100 mmol·L－1。Tricaine methanesulfonate(MS222)，購(gòu)自 Sigma公司。

1.1.2 儀器 Noldus EthoVision XT 8.5(荷蘭 Noldus公司提供)。

1.1.3 動(dòng)物 野生型AB系斑馬魚，由南方醫(yī)科大學(xué)斑馬魚實(shí)驗(yàn)中心提供，魚齡:4～7個(gè)月。養(yǎng)魚系統(tǒng)為北京愛生公司凈水系統(tǒng)，系統(tǒng)溫度控制在28.5℃ ～29.5℃;鹽濃度為0.03% ～0.04%;pH 7.2～7.6;晝夜光照控制14 h光照(8∶30 am～10∶30 pm)，10 h黑夜。正常喂食，每天兩次，實(shí)驗(yàn)用魚♀♂各半(50∶50)，且在實(shí)驗(yàn)前于獨(dú)立安靜的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)3～5 d。

1.2 方法

1.2.1 CPP箱的制作 參考小鼠CPP箱的制作方法及參考文獻(xiàn)［12］，取塑料魚缸，長(zhǎng)16 cm，寬9 cm，高9 cm。將魚缸分為等體積的兩個(gè)箱，一箱為褐色，一箱為透明，兩箱中間用一個(gè)透明的活動(dòng)擋板隔開。

1.2.2 斑馬魚基線測(cè)定 斑馬魚在獨(dú)立的CPP箱(抽出擋板)中適應(yīng)性喂養(yǎng)2d，CPP箱中水位不低于5 cm。于d 3觀察其15 min，以頭部位置為準(zhǔn)記錄斑馬魚在兩箱中活動(dòng)時(shí)間?；€測(cè)定結(jié)果表明大于95%的斑馬魚偏愛于褐色箱體，故以CPP箱的褐色箱體部分作為斑馬魚的偏愛箱，透明箱體部分為非偏愛箱(伴藥箱)。此后斑馬魚基線測(cè)定以其在非偏愛箱中的活動(dòng)時(shí)間≥8 min為合格。

1.2.3 CPP模型建立 (1)分組:取基線測(cè)定合格的斑馬魚60 條，稱重，隨機(jī)分為生理鹽水組，30、40、50、60、90 μg·g－1嗎啡劑量組，每組10條，♀♂各半。(2)觀察:于正式實(shí)驗(yàn)d1測(cè)定斑馬魚15 min內(nèi)于CPP箱透明側(cè)(非偏愛箱)的活動(dòng)時(shí)間，并用Noldus EthoVision XT 8.5軟件追蹤斑馬魚在CPP箱中的運(yùn)動(dòng)軌跡(5 min)。(3)訓(xùn)練:于實(shí)驗(yàn)d 2、d 4、d 6將斑馬魚浸入50 mg·L－1的tricaine methanesulfonate溶液中進(jìn)行麻醉(麻醉以用手能順利撈起斑馬魚但其仍保持正常游動(dòng)姿勢(shì)為度)，用微量注射器迅速腹腔注射各濃度嗎啡(空白組注射生理鹽水)，再將其放入系統(tǒng)水中30 s，待其麻醉恢復(fù)后，放入伴藥箱內(nèi)40 min，同時(shí)用透明擋板隔開，訓(xùn)練結(jié)束后將斑馬魚移至較大的有藍(lán)色環(huán)境的魚缸中，并清洗CPP箱。d 3、d 5同一時(shí)間斑馬魚腹腔注射與嗎啡同體積生理鹽水，將其放入偏愛箱內(nèi)40 min。(4)觀察:在末次給藥24 h后，即d 7再次測(cè)定斑馬魚在非偏愛箱中的活動(dòng)時(shí)間并比較訓(xùn)練前后各條斑馬魚在伴藥箱活動(dòng)時(shí)間的差值(斑馬魚訓(xùn)練后在伴藥箱中的活動(dòng)時(shí)間﹣斑馬魚訓(xùn)練前在伴藥箱中的活動(dòng)時(shí)間)，同時(shí)分析斑馬魚在非偏愛箱中的運(yùn)動(dòng)軌跡及運(yùn)動(dòng)總路程。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚訓(xùn)練前后在伴藥箱的活動(dòng)時(shí)間變化 Tab 1顯示，以腹腔注射給藥的方式，各組斑馬魚訓(xùn)練之前在伴藥箱的活動(dòng)時(shí)間無(wú)差異(P＞0.05)，而腹腔注射嗎啡并進(jìn)行連續(xù)3 次訓(xùn)練后，40、50、60 μg·g－1嗎啡組斑馬魚在伴藥箱中的活動(dòng)時(shí)間比訓(xùn)練前均明顯增加(P＜0.05)，而比較訓(xùn)練前后時(shí)間的差值，40、50 μg·g－1嗎啡組斑馬魚與生理鹽水組比較差異有顯著性(P＜0.01)，說(shuō)明腹腔注射40～50 μg·g－1嗎啡并對(duì)斑馬魚進(jìn)行連續(xù)3次訓(xùn)練能夠誘導(dǎo)其CPP的形成。

Tab 1 Change of activity time of zebrafish in non-preferred compartment between pre-and post training by intraperitoneal injection of morphine(ˉ ± s，n=10)

Tab 1 Change of activity time of zebrafish in non-preferred compartment between pre-and post training by intraperitoneal injection of morphine(ˉ ± s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs pre-training;△△P＜0.01 vs saline

Group Dose/μg·g－1 Zebrafish activity time in non-preferred compartment/s Pre-training Post three trainings Time difference between pre-and post three training/s Saline － 194.00 ±98.298 190.40±84.827 －3.60±66.700 Morphine 30 212.40 ±87.746 239.70 ±100.428 27.30 ±78.974 40 195.70 ±113.091 530.30±145.488＊＊ 334.60±164.661△△50 192.60 ±81.011 376.50±110.251＊＊ 183.90±170.466△△60 213.40 ±95.807 298.60 ±124.406* 85.20 ±108.912 90 172.10 ±81.620 250.40 ±165.076 78.30 ±148.417

2.2 斑馬魚訓(xùn)練前后在伴藥箱中的運(yùn)動(dòng)總路程變化 利用Noldus EthoVision XT 8.5軟件分析出斑馬魚5 min內(nèi)在伴藥箱中的運(yùn)動(dòng)總路程。由Tab 2可知，各組斑馬魚訓(xùn)練之前，在伴藥箱中的運(yùn)動(dòng)路程無(wú)差異，而訓(xùn)練之后，40、50 μg·g－1嗎啡組斑馬魚在伴藥箱中的總路程明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)。

Tab 2 Change of total movement path of zebrafish innon-preferred compartment within 5min(ˉ±s，n=10)

Tab 2 Change of total movement path of zebrafish innon-preferred compartment within 5min(ˉ±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs pre-training;△△P ＜0.01 vs saline

Group Dose/μg·g－1 Total movement path of zebrafish in non-preferred compartment/cm Pre-training Post three trainings Saline － 149.63 ±97.64 199.18 ±180.91 Morphine 30 116.63 ±101.65 162.98 ±172.57 40 204.21 ±159.89 662.71 ±171.65△△＊＊50 192.71 ±182.90 529.52 ±312.16△△＊＊60 183.21 ±177.04 345.27 ±165.35*90 221.09 ±169.27 153.24 ±172.98

2.3 斑馬魚造模前后在CPP箱的活動(dòng)軌跡圖 斑馬魚連續(xù)3次注射嗎啡后，其在非偏愛箱中的運(yùn)動(dòng)軌跡均有增多，而以注射40 μg·g－1的嗎啡斑馬魚的軌跡改變最為明顯，見Fig 1。

Fig 1 Activity route of two zebrafish groups in CPP compartment

3 討論

CPP的形成機(jī)制可能與一些經(jīng)典的條件反射實(shí)驗(yàn)相似，其基本原理是以某種自然獎(jiǎng)勵(lì)或成癮藥物作為非條件刺激，將其與某個(gè)特定的非獎(jiǎng)賞中性刺激(如某特定環(huán)境)反復(fù)相聯(lián)系之后，后者便可獲得某種獎(jiǎng)賞特性，即這一特定非獎(jiǎng)賞中性刺激可以誘發(fā)最初與非條件刺激聯(lián)系在一起的那種非條件行為效應(yīng)［13］。CPP實(shí)驗(yàn)是目前國(guó)內(nèi)外評(píng)價(jià)藥物精神依賴性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，也是廣泛應(yīng)用于尋找抗覓藥行為的有效工具。本研究通過(guò)對(duì)嗎啡誘導(dǎo)的斑馬魚CPP條件的探索，旨在選取建立斑馬魚嗎啡依賴模型的最佳條件。本研究前期采用浸泡給藥的方法，單次訓(xùn)練和連續(xù)3次訓(xùn)練之后，均無(wú)法使其在伴藥箱中的活動(dòng)時(shí)間明顯增強(qiáng)。導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能是嗎啡藥液的濃度不夠，也可能因?yàn)榻萁o藥斑馬魚對(duì)藥物的吸收程度過(guò)低，或者訓(xùn)練次數(shù)的不足。

通過(guò)改進(jìn)給藥方法，采用腹腔注射給藥的方式，斑馬魚在單次注射嗎啡之后即能產(chǎn)生不同程度的CPP效應(yīng)，而通過(guò)連續(xù)3次訓(xùn)練之后，注射40～60 μg·g－1的嗎啡都能使斑馬魚在伴藥箱中的活動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，但注射90 μg·g－1的嗎啡卻不能引起斑馬魚在伴藥箱中的活動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，說(shuō)明過(guò)高劑量的嗎啡對(duì)斑馬魚形成CPP無(wú)益。與生理鹽水組相比，僅40、50 μg·g－1的嗎啡能引起斑馬魚訓(xùn)練前后在伴藥箱的活動(dòng)時(shí)間差值明顯增大，說(shuō)明誘導(dǎo)斑馬魚形成CPP的最佳嗎啡濃度為 40 ～50 μg·g－1。

斑馬魚經(jīng)過(guò)連續(xù) 3 次訓(xùn)練之后，40、50 μg·g－1嗎啡組在伴藥箱中的運(yùn)動(dòng)總路程明顯延長(zhǎng)。表明給藥訓(xùn)練之后，斑馬魚對(duì)伴藥箱的偏愛大大增加，無(wú)論是在伴藥箱中的活動(dòng)時(shí)間，還是運(yùn)動(dòng)總路程，都證明連續(xù)3次注射嗎啡的訓(xùn)練能誘導(dǎo)斑馬魚位置偏愛的形成。而綜合斑馬魚訓(xùn)練前后在伴藥箱中活動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)總路程的結(jié)果，初步探索出采用腹腔注射給予40～50 μg·g－1嗎啡，并經(jīng)過(guò)連續(xù)3次訓(xùn)練，能建立穩(wěn)定的斑馬魚CPP模型。

斑馬魚連續(xù)注射不同劑量的嗎啡，僅 40、50 μg·g－1嗎啡組的斑馬魚在伴藥箱中的活動(dòng)時(shí)間明顯增加，運(yùn)動(dòng)總路程明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明斑馬魚產(chǎn)生CPP效應(yīng)的嗎啡劑量范圍較窄。當(dāng)嗎啡劑量低于40 μg·g－1時(shí)，斑馬魚的CPP效應(yīng)明顯降低，當(dāng)劑量為30 μg·g－1時(shí)，斑馬魚在CPP箱中的活動(dòng)時(shí)間變化差異已無(wú)顯著性。因此，在建模過(guò)程中嗎啡的濃度選擇非常重要，這也是本模型建立成功的關(guān)鍵所在。

在研究中，除了對(duì)嗎啡劑量、訓(xùn)練次數(shù)以及給藥方法的控制外，應(yīng)要求對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中環(huán)境溫度，系統(tǒng)水溫嚴(yán)格控制，并盡最大可能避免人為因素的干擾。腹腔注射給藥具有給藥劑量小且劑量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。斑馬魚腹腔注射的操作應(yīng)迅速、準(zhǔn)確，減小操作對(duì)斑馬魚行為的影響，注射時(shí)可用一塊帶有凹槽(寬度與斑馬魚體寬接近，凹槽中添加系統(tǒng)水)的瓊脂板對(duì)處于淺麻醉狀態(tài)的斑馬魚進(jìn)行固定，可避免其在操作過(guò)程中離開水時(shí)間過(guò)長(zhǎng)所造成的傷害。在每次斑馬魚給藥訓(xùn)練結(jié)束之后，應(yīng)及時(shí)用70%的乙醇清洗CPP箱，因斑馬魚對(duì)氣味的刺激極其敏感，當(dāng)使用同一個(gè)CPP箱進(jìn)行多輪或多次實(shí)驗(yàn)時(shí)，斑馬魚可能因嗅覺的影響模仿前一條斑馬魚的軌跡來(lái)運(yùn)動(dòng)，而不是根據(jù)其本身在CPP中的天然偏愛進(jìn)行活動(dòng)。

斑馬魚因具有生長(zhǎng)快速，研究周期短，給藥劑量小且飼養(yǎng)方便等諸多優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多地應(yīng)用于各種藥物的高通量篩選。與哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單，但其能極好地控制學(xué)習(xí)、成癮、抑郁等復(fù)雜行為，這種組織與系統(tǒng)間簡(jiǎn)單性與復(fù)雜性的良好平衡，使得其在研究藥物對(duì)其行為影響方面極具優(yōu)勢(shì)［12］。國(guó)外研究表明，斑馬魚體內(nèi)存在與哺乳動(dòng)物功能相似的阿片受體，而且該受體與嗎啡的成癮性有關(guān)［14］。Mathur等［7］研究結(jié)果也顯示將斑馬魚暴露于低劑量的嗎啡即能誘導(dǎo)其在嗎啡藥液側(cè)活動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)藥物依賴的研究主要集中于大、小鼠模型，而單一的模式生物在研究中有很大的局限性，因此，將斑馬魚引入毒癮醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，利用斑馬魚的各項(xiàng)生物學(xué)優(yōu)勢(shì)為藥物依賴研究服務(wù)，不僅豐富了藥物依賴的模型，而且為將來(lái)成癮戒斷藥物的篩選提供更有力的保障。

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