胡 平，林開春

(1.恩施職業(yè)技術學院 生物工程系，湖北 恩施 445000； 2.華中農(nóng)業(yè)大學 植物科學與技術學院，湖北 武漢 430070)

響應面分析法優(yōu)化交沙霉素發(fā)酵培養(yǎng)基

胡 平1，2，林開春2*

(1.恩施職業(yè)技術學院 生物工程系，湖北 恩施 445000； 2.華中農(nóng)業(yè)大學 植物科學與技術學院，湖北 武漢 430070)

以交沙霉素產(chǎn)生菌R29為供試菌株，采用響應面法綜合實驗設計，利用SAS分析軟件對交沙霉素發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化.結果表明：棉籽餅粉和豆油為主效應因素，且培養(yǎng)基中棉籽餅粉和豆油最佳比例分別為1.9%和0.405%時，預測交沙霉素的發(fā)酵效價為220.6 μg/mL.經(jīng)驗證試驗，最優(yōu)條件下交沙霉素的發(fā)酵效價為221.8 μg/mL，與預測值相近，比原始配方下交沙霉素的發(fā)酵效價提高了10.66%.說明優(yōu)化的發(fā)酵配方確實比初始配方更有利于菌株R29的產(chǎn)素.

響應面分析法；交沙霉素；發(fā)酵培養(yǎng)基

交沙霉素是那波鏈霉菌交沙霉素變種(Streptomycesnarbonensisvar.Josamyceticus)產(chǎn)生的一種十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生藥物，于1964年由日本山之內(nèi)制藥株式會社研制而成，對葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎雙球菌和百日咳桿菌、梭狀芽胞桿菌、白喉桿菌、炭疽桿菌、布氏桿菌、軍團菌、螺旋桿菌、支原體、立克次體、衣原體、螺旋體等亦有較好抗菌作用[1]，臨床用于呼吸道感染、支氣管炎、肺炎、副鼻竇炎、中外耳炎、皮膚感染、術后創(chuàng)口感染、泌尿科、五官科、口腔科感染等，療效確切.自誕生以來，它就在世界范圍內(nèi)廣泛應用于臨床了[2-3].但是在國內(nèi)的應用僅處于起步階段，目前尚無廠家生產(chǎn)原藥，具有相當大的研發(fā)潛能.為盡快實現(xiàn)交沙霉素原料藥的國產(chǎn)化，首先要提高交沙霉素產(chǎn)生菌的產(chǎn)素能力，而優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基是其中的關鍵環(huán)節(jié)之一.近年來，國內(nèi)外很多研究人員利用響應面分析法(Response Surface Analysis，RSA)在培養(yǎng)基優(yōu)化方面取得了良好的效果[4-6].筆者以本實驗室的交沙霉素產(chǎn)生菌R29為供試菌株，采用響應面法綜合實驗設計，利用SAS分析軟件對發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，為該菌的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供現(xiàn)實依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌種

交沙霉素產(chǎn)生菌那波鏈霉菌交沙霉素變種(Streptomycesnarbonensisvar.Josamyceticus)R29菌株，由武漢天惠生物工程有限公司提供.

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基 土豆泥10%,麥片2.5%,精氨酸0.02%,瓊脂2%,消前pH7.2～7.4.

1.2.2 種子培養(yǎng)基 葡萄糖1.0%,淀粉1.0%,黃豆餅粉1.5%,硫酸鎂0.05%,酵母粉0.5%,碳酸鈣0.3%,磷酸氫二鉀0.5%.消前pH8.0.

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖2.0%,棉籽餅粉2.0%,豆油1.0%,碳酸鈣0.3%,玉米淀粉4.0%,磷酸二氫鉀0.03%,面筋粉2.0%,硫酸鎂0.05%,氯化鈉0.1%,消前pH8.0.

1.3 菌種發(fā)酵

將保藏的斜面菌種用竹簽打塊接入種子培養(yǎng)基，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)34 h.將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量8%，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)8 d.

1.4 交沙霉素檢測

采用高效液相色譜法(HPLC)：色譜柱為C18反向柱(填料Hypersil ODS 25 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫為室溫；流動相為磷酸緩沖液(0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用1 mol/L的磷酸調(diào)節(jié)pH值為3)-甲醇(體積比為20∶80，pH 3)；流速為1.0 mL/min；紫外檢測波長為232 nm；進樣量為10 μL；交沙霉素參考品為杭州民生藥業(yè)生產(chǎn)的交沙霉素糖衣片，含量200 mg/片.

表1 試驗因素編碼水平及結果

1.5 優(yōu)化設計方法

1.5.1 Placket-burman (PB)設計 采用PB設計的兩水平法對交沙霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基的9種成分進行試驗，篩選交沙霉素發(fā)酵的主效應因素.

1.5.2 最陡爬坡試驗 根據(jù)方法1.5.1中得出的一次擬和方程設計最陡爬坡試驗.方程中變量的系數(shù)如果為正，則該水平應設計為遞增，反之遞減；變量系數(shù)的大小決定變化幅度，系數(shù)越大，變化的幅度越小，反之越大.

1.5.3 Box-wilson中心組合設計和響應面分析 以方法1.5.2中得到的中心點，根據(jù)Box-wilson中心組合設計原理設計響應面分析試驗.根據(jù)響應面試驗設計結果，運用SAS軟件進行回歸擬合，得到模型方程，根據(jù)所得模型的響應面分析立體圖，結合回歸方程，求得模型極值點，該點代表的主效應因子數(shù)據(jù)即為預測的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方比例值.

1.5.4 驗證性試驗 分別在預測最優(yōu)發(fā)酵條件和初始條件下進行發(fā)酵試驗，重復5次，根據(jù)交沙霉素在預測最優(yōu)發(fā)酵條件下的實際平均效價值，與初始條件下的結果進行比較，驗證該模型的預見是否準確，從而確定交沙霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方.

2 結果與分析

2.1 PB設計試驗結果

以R29為供試菌株進行PB設計的試驗方案及結果見表1、表2.表1中棉籽餅粉和豆油的Pr>|t|分別為0.034和0.022，即表示這兩個因素在95%的置信區(qū)間顯著.

用SAS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到一次回歸方程：

Y=427-32.0A+6.17B-7.00C-2.17D-40.2E+4.17F+4.83G-1.67H-2.50J.

經(jīng)過回歸數(shù)據(jù)分析，R-Sq=97.5%，R-Sq(adj)=86.1%，系數(shù)數(shù)值大，表明擬合良好，P=0.048，小于0.05，表明回歸方程擬合良好.

根據(jù)表1中t-檢驗結果可知，棉籽餅粉和豆油為重要因素，在95%置信區(qū)間其可信度分別為96.6%和97.8%，可考慮作為主效應因子進行下一步的優(yōu)化試驗.

表2 Placket-burman試驗設計結果

表3 最陡爬坡試驗設計及試驗結果

表4 中心組合設計試驗變量及水平

表5 響應面試驗設計及結果

圖1 響應面立體分析圖Fig.1 The graph of response surface analysis

2.2 最陡爬坡試驗結果

根據(jù)PB試驗結果可知棉籽餅粉和豆油為重要因素，而葡萄糖、碳酸鈣、玉米淀粉、磷酸二氫鉀、面筋粉、氯化鈉和硫酸鎂均對交沙霉素的產(chǎn)出無顯著影響，這些因素保持原始水平不變.根據(jù)PB試驗得出的一次擬和方程對棉籽餅粉和豆油進行最陡爬坡試驗，結果如表3所示.可知最優(yōu)條件在處理6和處理7之間，故采用1.9%棉籽餅粉，0.4%豆油為后續(xù)響應面試驗的中心點.

2.3 中心組合設計及響應面試驗設計結果

保持發(fā)酵培養(yǎng)基配方中除棉籽餅粉和豆油以外的其它6個因素水平不變，以中心點(棉籽餅粉1.9%，豆油0.4%)，對棉籽餅粉和豆油兩個因素進行中心試驗組合設計.中心點重復5次，保證擬合方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性，中心組合試驗設計見表4，響應面試驗設計及結果見表5.

將相應面中得到的數(shù)據(jù)，利用SAS軟件回歸擬合，得到交沙霉素效價的二次經(jīng)驗模型為：Y=546.80+3.81A+7.21B-95.34A2-85.34E2+11.75AE；同時得到響應面分析立體圖見圖1，從圖1可以看出，棉籽餅粉和豆油對交沙霉素產(chǎn)出的效應存在著一定的交互作用.對Y進行回歸系數(shù)評估，結果表明A2和E2在大于F值的概率(Pr>F)分別為0.001、0.002，即A2和E2為顯著影響項；變異系數(shù)的分析表明，2次項影響在大于F值的概率(Pr>F)為0.001，即2次項影響為顯著影響項；方差分析數(shù)據(jù)表明在大于F值的概率(Pr>F)為0.005，說明回歸方程有很高的可靠性和顯著性；且擬合方程的決定系數(shù)R2值為0.959 9，表明該方程與實際有很好的擬合性，可用來進行交沙霉素發(fā)酵效果的分析和預測.根據(jù)回歸方程結合響應面分析立體圖，求得模型極值點為A=0，E=0.05，對應棉籽餅粉和豆油分別為1.9%和0.405%，此時預測交沙霉素的發(fā)酵效價為220.6 μg/mL.

2.4 驗證性試驗結果

選用菌株R29在預測最優(yōu)條件即和發(fā)酵初始條件下進行發(fā)酵試驗，得到實際平均交沙霉素發(fā)酵效價分別為221.8 μg/mL和200.4 μg/mL，最優(yōu)條件下交沙霉素的發(fā)酵效價與預測值相近，說明該模型能準確的預見交沙霉素的實際發(fā)酵效價，同時優(yōu)化得到的發(fā)酵培養(yǎng)基配方下交沙霉素的發(fā)酵效價比原始配方下交沙霉素的發(fā)酵效價提高了10.66%，說明優(yōu)化的發(fā)酵配方確實比初始配方更有利于菌株R29的產(chǎn)素.

3 討論

通常發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法是采用單因素試驗，但單因素試驗因無法考察到各因素之間的交互影響而存在一定的局限性，因而該方法不是總能獲得最佳條件[7].此外，若考察的因素較多，則實驗次數(shù)會較多，周期長，為了彌補單因素試驗的缺陷，許多研究人員在單因素試驗的基礎上采用了正交設計法[8-9]、二次正交旋轉(zhuǎn)組合設計[10]、均勻設計法[11，12]、改進單純形法[13-14]和響應面分析[15]等方法進行條件的優(yōu)化工作.本試驗首次將PB設計、最陡爬坡試驗、中心組合設計和響應面分析等方法運用于交沙霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗中，并借助SAS統(tǒng)計軟件快捷可靠地獲得了較優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，取得了較好的效果.因此，采用相應面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基是一種行之有效的實驗方法，但此研究僅限于搖瓶發(fā)酵，仍需上罐分批發(fā)酵進一步驗證，而且，本試驗并未對裝料量、通氣、起始pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、誘導物、前體物質(zhì)和補料等其他的發(fā)酵工藝參數(shù)進行研究試驗，對這些發(fā)酵條件尚需進一步探索.

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OptimizationofFermentationMediumforJosamycinUsingResponseSurfaceAnalysis

HU Ping1，2，LIN Kai-chun2*

(1.Department of Biological Engineering，Enshi Technical College，Enshi 445000，China； 2.College of Plant Science and Technology，Huazhong Agriculture University，Wuhan 430070，China)

Experiments were designed to optimize the fermentation medium of josamycin R29 by the response surface analysis, using SAS analysis software to optimize.The results showed that the main effect factors were cottonseed cake powder and soybean oil,and the fermentation titer of josamycin was expected to be 220.6 μg/mL when the proportion of cottonseed cake powder and soybean oil was 1.9% and 0.405% respectively.And the validation test showed that,the josamycin fermentation titer was 221.8 μg/mL in the optimal conditions，similar to forecast,which was 10.66% higher than the initial medium components before optimization,showing that optimization of the fermentation medium does more than the original.

response surface analysis; josamycin; fermentation

2013-05-08.

武漢天惠生物工程有限公司自籌項目.

胡平(1981- )，女，講師，碩士，主要從事生物制藥技術的教學與研究；*

：林開春(1949- )，男，副教授，碩士，主要從事發(fā)酵工業(yè)方面的研究.

Q816；TQ92

A

1008-8423(2013)02-0138-04