張雅麗，李建科，劉 柳，于 振，馬倩倩，李夢穎

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

五倍子（Galla Chinensis）別名百蟲倉、文蛤，為癭綿蚜科（Pemphigidae）的一些蚜蟲寄生在漆樹科鹽膚木屬植物的葉上形成的囊狀蟲癭。五倍子是我國傳統(tǒng)中藥，最早記載于《開寶本草》[1]，具有斂肺降火、斂汗、止血等功效[2]，含有單寧、沒食子酸、五倍子油等成分，其中單寧可高達80%[3]。我國是五倍子的主要生產(chǎn)國家，在世界總產(chǎn)量中占95%左右；我國五倍子不僅產(chǎn)量大，而且品質(zhì)高，主產(chǎn)區(qū)集中在貴州、陜西、四川、云南等省[4-5]。沒食子酸（Gallic acid）是五倍子的主成分之一，約占2%～4%，是一種天然的多酚類化合物，具有抗氧化、抑菌、防齲齒等生物活性[6]。我國五倍子所含的單寧屬于水解單寧[7]，工業(yè)上通過水解五倍子單寧獲得沒食子酸，可用于醫(yī)藥、有機合成和食品、農(nóng)業(yè)、礦產(chǎn)等領(lǐng)域，并作為商品出口，具有很大的應(yīng)用價值。本文將就五倍子沒食子酸的制備、測定方法、生物活性等進行綜述。

1 沒食子酸的理化性質(zhì)

沒食子酸（Gallic acid）化學(xué)名稱為3，4，5-三羥基苯甲酸，分子式為C7H6O5，分子量為170.12，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示，通常以一水合物的狀態(tài)存在，是白色或微黃色針狀晶體，常溫時（25℃）微溶于水，易溶于沸水、乙醚、丙酮等，不溶于氯仿、苯等有機溶劑。沒食子酸具有強還原性，遇空氣中的氧變成褐色，還可與蛋白質(zhì)、凝膠、重金屬、生物堿等結(jié)合[8]。它是植物體中一類次生代謝產(chǎn)物，以游離酸或形成酯類化合物的形式存在于五倍子、茶、沒食子等植物中，屬于低毒物質(zhì)[9]。經(jīng)由沒食子酸生成的沒食子酸丙酯、次沒食子酸鉍等多種衍生物，可用于食品、制藥及輕工等行業(yè)[10]。

圖1 沒食子酸結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of Gallic acid

2 沒食子酸的制備

圖2 五倍子單寧水解生產(chǎn)沒食子酸反應(yīng)式Fig.2 Hydrolysis Equation of Gallic acid from Galla Chinensis

五倍子單寧由沒食子酸、雙倍酸與葡萄糖以酯或甙的形式結(jié)合，可在酸、堿等作用下水解生成沒食子酸，制備過程如圖2所示。

通過五倍子生產(chǎn)沒食子酸的途徑有化學(xué)法和生物法。化學(xué)法包括酸水解法和堿水解法，生物法包括酶法和發(fā)酵法[11]。五倍子單寧在完全水解的情況下，可生成7～9分子的沒食子酸。

2.1 酸水解法

酸水解法，是五倍子單寧浸提液在加熱的條件下，以酸為催化劑進行的催化反應(yīng)。此時一分子單寧與n分子的水反應(yīng)，生成一分子葡萄糖和n分子（n為6、7、8）沒食子酸。

王廣娟[12]以五倍子生品為原料，考察了溫度、酸度、時間以及料液比等因素對提取沒食子酸影響的大小，發(fā)現(xiàn)酸度及時間對結(jié)果有顯著的影響，在經(jīng)正交優(yōu)化后所得最佳提取條件為溫度100℃，鹽酸濃度4mol/mL，時間3h，料液比1∶80，此時沒食子酸得率為56.3%。瞿燕[13]考察了五倍子酸解時所用酸種類，選取硫酸和鹽酸作為研究因素，沒食子酸得率分別為18.75%、18.40%；雖然兩者無顯著差異，但因為鹽酸易揮發(fā)，所以選擇鹽酸。韋國鋒等[14]改進酸水解工藝，取消了制冷設(shè)備，不僅縮短生產(chǎn)周期、減少費用，而且在新工藝下沒食子酸提取率可達14.8%以上。

在工業(yè)化生產(chǎn)中，酸解法使用時間長、經(jīng)驗多，但由于單寧不能完全水解，沒食子酸收率較低，對含單寧低的五倍子原料不能利用；反應(yīng)過程所使用的酸，對設(shè)備腐蝕大，縮短了使用壽命，加速了折舊進程；并且所產(chǎn)生的葡萄糖，在長時間的酸性和高溫環(huán)境下可生成色素物質(zhì)5’-羥甲基糖醛，需用活性炭進一步脫色，由此生成的廢液會污染環(huán)境[15]。

2.2 堿水解法

堿水解法，是五倍子單寧浸提液在堿性條件下水解，再用酸中和、酸化進而生成沒食子酸的過程。

黃嘉玲等[16]通過堿水解法獲得了制備高收率、高質(zhì)量的沒食子酸的最優(yōu)工藝，并在質(zhì)量上主要解決了五倍子提取物水解產(chǎn)物在顏色上的問題，此時沒食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及顏色都符合出口標(biāo)準(zhǔn)，并為進一步擴大生產(chǎn)及工業(yè)化提供了依據(jù)。相對于酸水解法，堿水解法反應(yīng)時間短，對設(shè)備腐蝕小，延長了設(shè)備的壽命，陳茜文等[17]又進一步以五倍子單寧酸為研究對象，考察了水解時反應(yīng)溫度、時間和堿液濃度對沒食子酸得率的影響，并且通過正交實驗和極差分析獲得最優(yōu)條件為單寧酸與氫氧化鈉物質(zhì)的量比為1∶38，時間100min，溫度106℃，此時得率達到48.3%，增加了5%～6%，并且產(chǎn)物中沒有絮狀物質(zhì)。但是從單寧化學(xué)性質(zhì)上分析，單寧在堿性環(huán)境中易被氧化。陳笳鴻等[18]發(fā)現(xiàn)延長堿水解法中反應(yīng)時間會使得率降低，去氧保護會增加實際生產(chǎn)中的難度。因此應(yīng)適當(dāng)縮短堿水解時間，減少單寧氧化的不利影響。并且堿水解法工藝過程比較復(fù)雜，也會產(chǎn)生色素物質(zhì)，需進一步脫色，增加成本，生成的廢液同樣污染環(huán)境[19]。

2.3 酶法

酶法的關(guān)鍵是篩選、獲得活力高的單寧酶。單寧酶（Tannase，EC3.1.1.20）為?；饷?，是誘導(dǎo)型胞外酶，可高效、定向裂解單寧中的酯鍵、糖苷鍵和縮酚酸鍵[20-21]。單寧酶主要由真菌產(chǎn)生，如曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）微生物，特別是曲霉屬中的黑曲霉（Aspergillus niger）[22]。五倍子單寧可在單寧酶的作用下水解生成沒食子酸[23]。

王嘯等[24]先以五倍子固體和黑曲霉B0201發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶，再用酶法制備沒食子酸；反應(yīng)4h時，100mL單寧酶酶液中生成了0.77g沒食子酸，建立了一種黑曲霉單寧酶兩步法制備沒食子酸的工藝。郭魯宏等[25]以海藻酸鈣為載體，包埋黑曲霉單寧酶，研究了固定化條件和固定化單寧酶的一些性質(zhì)，并在最優(yōu)條件下利用固定化酶進行了沒食子酸克量級制備實驗，產(chǎn)品平均得率為61%，具有潛在的開發(fā)價值。張楚晗等[26]直接以單寧酶與五倍子作用，4h后沒食子酸產(chǎn)量比空白組高6倍左右，但是不同單寧酶用量間的沒食子酸得率差別不大。

酶法與化學(xué)水解法相比，其特點是底物水解完全，原料利用率高，反應(yīng)時間短，并且可在常壓下進行，所需條件溫和，能量消耗低，對環(huán)境污染小[23]。但生產(chǎn)單寧酶的費用昂貴[27]。

2.4 發(fā)酵法

發(fā)酵法是利用微生物在含單寧的溶液中發(fā)酵，而微生物經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生單寧酶，進一步對單寧進行水解生成沒食子酸過程。

楊亞力等[28]將篩選到的兩株具有高單寧酶活性的黑曲霉菌株接種于含有五倍子單寧的液體中，利用發(fā)酵程序，在反應(yīng)48h后沒食子酸的質(zhì)量濃度分別達到20.6mg/mL和21.3mg/mL，具有很好的工業(yè)開發(fā)前景。胡昌江等[29]在以五倍子為原料，選以酵曲量、茶葉量和發(fā)酵時間為研究對象，并在最佳發(fā)酵工藝下，發(fā)酵72h后，沒食子酸的量只達到26.75%。F議Regerat等[30]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的種類可影響發(fā)酵開始的時間，五倍子浸提液培養(yǎng)基比五倍子生料培養(yǎng)基開始發(fā)酵的時間早。王蔚文等[31]通過實驗室擴大實驗，使用的發(fā)酵罐容積為20L，種量為10%，發(fā)酵5～6天后，沒食子酸的得率為五倍子原料的40%。

雖然發(fā)酵法能耗低，廢液對環(huán)境污染小，但存在的主要問題是酶的生成和單寧的水解在同一個容器中發(fā)生，反應(yīng)條件不能達到最佳狀態(tài)，導(dǎo)致單寧水解不完全，反應(yīng)時間增長[19]。

綜上所述，化學(xué)法（酸水解法和堿水解法）都具有反應(yīng)時間短的特點，但是單寧均不能完全水解，沒食子酸得率較低，生成的廢液污染環(huán)境，并且酸水解法嚴(yán)重腐蝕設(shè)備。酶法和發(fā)酵法具有能耗低，廢液對環(huán)境污染小，沒食子酸的轉(zhuǎn)化率高的特點，其中酶法在4種方法中轉(zhuǎn)化率最高；但兩者反應(yīng)時間相對較長，其中發(fā)酵法在4種方法中反應(yīng)時間最長，并且酶法中所使用的單寧酶費用高。

3 沒食子酸的純化

沒食子酸是3，4，5-三羥基苯甲酸，其羧基和羥基是對位關(guān)系，性質(zhì)相對穩(wěn)定，可溶于乙醇、丙酮、乙醚和熱水中，不溶于苯、三氯甲烷等有機溶劑?？赏ㄟ^溶劑萃取法、超濾技術(shù)、樹脂法、雙水相萃取技術(shù)等對沒食子酸進行純化處理，而且傳統(tǒng)方法與新型方法在工藝流程、所得產(chǎn)品純度上均不同。

陳立宇等[32]采用溶劑萃取沒食子酸，研究了萃取劑的種類、濃度以及萃取的溫度、時間對萃取效果的影響，在所選取的萃取劑中，100%丁醇具有良好的萃取效果，一級萃取率為90%；并且丁醇價格便宜，供給豐裕，成本低。王廣娟等[33]又利用樹脂分離并純化五倍子中的沒食子酸，結(jié)果顯示D301型離子交換樹脂能更好的純化沒食子酸。在上樣質(zhì)量濃度3.316mg/mL，上樣液體積12BV，速率1mL/min時，樹脂處于動態(tài)飽和吸附狀態(tài)。再以18BV 70%乙醇，1mL/min的速率可完全洗脫。經(jīng)樹脂純化后，沒食子酸的純度由先前的42.4%增長到68.8%。離子交換樹脂不僅操作方便，可連續(xù)化生產(chǎn)，并且獲得的成品純度高，但需要在最佳條件下才能達到最優(yōu)效果。

4 沒食子酸的測定方法

4.1 高效液相色譜法

高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）又稱高速液相色譜，它以液體作為流動相，根據(jù)各種溶質(zhì)在色譜柱中不同的遷移速度而達到分離、分析的目的。

侯惠嬋等[34]建立了用高效液相色譜法來測定五倍子中沒食子酸的量，色譜柱為DiamonsilTMC18（200mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈-0.5%磷酸溶液（3∶97），沒食子酸在0.1～1μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r2=0.9999，RSD=1.9%（n=6），所測樣品1（角倍）中沒食子酸為1.88%。李寧等[35]也建立了高效液相色譜法測定五倍子沒食子酸的量，以phenomenex Luna 5μ C18（2）100A為色譜柱，甲醇-0.1%磷酸溶液（7∶93）為流動相，測得沒食子酸在0.082～0.818μg有良好的線性關(guān)系，r=0.9999，RSD=1.68%（n=9）。由于高效液相色譜法中各種測定條件，如色譜柱與流動類型、流速、檢測波長等，都可影響測定結(jié)果[36]，因此兩者所得最低檢測限不同，后者比前者低，可用于沒食子酸含量更低的樣品。

4.2 薄層掃描法

薄層掃描法（Thin-Layer Chromatography，TLC）指用一定波長的光照射到薄層上，對薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點進行掃描，進而進行定性定量分析[37]。

郭耀武等[38]探討以薄層掃描法測定五倍子中沒食子酸的量，采用50%乙醇為展開劑，0.5%三氯化鐵乙醇溶液為顯色劑，得到?jīng)]食子酸線性范圍為0.426～2.98μg，所測樣品中沒食子酸含量為3.5%～8.0%。劉新平等[39]采用薄層掃描法對倍芪腹瀉貼中五倍子主要成分沒食子酸的量進行測定，以36%醋酸為展開劑，0.5%三氯化鐵乙醇溶液為顯色劑，展開后只顯示一個斑點，沒有其他干擾，所得沒食子酸線性范圍為0.604～1.398μg。喬蓉霞等[40]在測定齒痛膜中五倍子主要成分沒食子酸含量時，以甲苯-醋酸乙醋-甲酸（8∶4∶1）為展開劑，0.1%三氯化鐵/乙醇溶液為顯色劑，展開后的斑點清楚干擾小，所得沒食子酸線性范圍為0.262～2.62μg，樣品981001中沒食子酸含量為13.22mg/g。由于三者所使用的檢測條件有差異，因此所得沒食子酸檢測限不同，但都簡單便捷、重復(fù)性高。

4.3 毛細管電泳法

毛細管電泳法（Capillary Electrophoresis，CE），是一類以毛細管為分離通道，高壓直流電場為驅(qū)動力，樣品的多種特性（電荷、大小等）為根據(jù)的液相微分離分析技術(shù)[36]，主要包括毛細管區(qū)帶電泳、毛細管凝膠電泳等，是近年來發(fā)展十分迅速的一種技術(shù)。

瞿海云等[41]探討了毛細管電泳高頻電導(dǎo)法測定五倍子沒食子酸的方法，考察了緩沖液、分離電壓等因素對分離測定的影響，并可在5.5min內(nèi)完成沒食子酸的測定，檢出限達1.0μg/mL。丁華等[42]采用毛細管區(qū)帶電泳法（capillary zone electrophoresis，CZE）測定石明止血合劑中石榴皮、五倍子的主要有效成分沒食子酸的量，該方法操作簡單，最低檢測質(zhì)量濃度為1.0μg/mL。付紹平等[43]同樣采用毛細管區(qū)帶電泳法測定沒食子酸量，其最低檢出限為3.0μg/mL，比上述兩種方法的檢出限高，這可能是由于運行緩沖液、電壓等檢測條件不同而導(dǎo)致的差異。

以上3種測定方法雖都簡便快捷、重復(fù)性好，但又有各自的特點。高效液相色譜法可用于測定熱穩(wěn)定性差或揮發(fā)性低的樣品，薄層掃描法可對沒食子酸進行快速定性分析，毛細管電泳法可用于微量樣品的測定。

5 沒食子酸的生物活性

5.1 抗氧化作用

機體內(nèi)的內(nèi)源或外源性自由基可使氧分子產(chǎn)生氧自由基，氧自由基可引發(fā)細胞內(nèi)外很多化合物的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等損傷[44]，進而引發(fā)機體病變[45]。因此，為保護機體免受自由基所造成的損傷，自由基清除劑顯得尤為重要[46]。五倍子沒食子酸含有較多鄰位酚羥基，可釋放氫與周圍的自由基結(jié)合，從而阻止自由基引起的連鎖反應(yīng)，抑制氧化反應(yīng)的進行，具有較強的抗氧化和捕捉自由基的能力。

于敏等[47]研究了五倍子多酚類物質(zhì)清除活性氧自由基的效果。通過采用電子自旋共振（（electron spin resonance，ESR）方法和電子自旋捕集技術(shù)，分別測定了不同質(zhì)量濃度的五倍子水提物和醇提物清除DPPH自由基的效果，證明五倍子多酚類物質(zhì)具有較好的抗氧化性能。代斌[48]研究了五倍子多酚提取物的抗氧化作用。在體外抗氧化實驗中，五倍子多酚提取物可有效清除超氧陰離子自由基、DPPH自由基和羥自由基；其對O2-·的清除效果略低于VC對照組，但對DPPH·的清除效果高于VC對照組；對·OH的清除效果高于D-甘露醇，當(dāng)兩者質(zhì)量濃度同為0.25mg/mL，五倍子多酚提取物的清除率為58.03%，而D-甘露醇為13.56%；此外還可抑制由Fe2+引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并表現(xiàn)出較強的還原能力，具有良好的劑量依賴關(guān)系。在線粒體抗氧化實驗中，五倍子多酚提取物可使膜內(nèi)外滲透壓保持穩(wěn)定，線粒體的腫脹速率減小，并可使蛋白質(zhì)羰基的量降低，ATP酶酶活恢復(fù)，有保護生物膜的功能。

5.2 抗病毒作用

李紅霞[49]在研究五倍子乙醇提取物對煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的抑制作用時，發(fā)現(xiàn)其有效成分中抗病毒作用最強的是沒食子酸。通過實時定量RT-PCR反轉(zhuǎn)錄合成病毒核酸發(fā)現(xiàn)，沒食子酸在一定程度上對病毒核酸的生成起到抑制作用；通過測定外殼蛋白亞基發(fā)現(xiàn)，沒食子酸也在一定程度上影響病毒外殼蛋白在體外的聚合。結(jié)果顯示，沒食子酸可妨礙煙草花葉病毒的正常組裝程序，并可有效的抑制病毒的復(fù)制。

病毒通過黏附宿主細胞從而進入其內(nèi)，并合成和翻譯信使RNA，進而復(fù)制病毒DNA或RNA，最終形成新的病毒?？共《疚镔|(zhì)主要通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶等關(guān)鍵點來發(fā)揮作用，而對病毒與宿主細胞和機體間的關(guān)系以及更多抗病毒關(guān)鍵位點有待進一步的研究[50]。在日常生活中，病毒性疾病一直是困擾人們的重大問題。目前，一些常用抗病毒藥物，如核苷類、生物類藥物，均可對機體造成一定損害。因此，具有抗病毒活性的天然化合物（如多酚類物質(zhì)）炙手可熱。并且隨著分離、純化技術(shù)的進一步發(fā)展，以及各種生物技術(shù)的應(yīng)用，對天然抗病毒活性成分的研究將越來越受到關(guān)注。

5.3 抑菌作用

食品作為人類生存的基礎(chǔ)物質(zhì)，并且隨著社會經(jīng)濟發(fā)展、生活水平的提高，人們越來越重視對食源性致病菌的控制。食品中常見致病菌有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、單核細胞增生李斯特菌、空腸彎曲桿菌等，可引起惡心、頭痛、嘔吐、腹瀉等[51-52]。由于人們對化學(xué)合成抑菌劑的安全的質(zhì)疑，安全、綠色、天然的抑菌劑倍受關(guān)注。許多植物都可產(chǎn)生具有抑菌作用的次級代謝產(chǎn)物[53]，因而從植物中獲得具有抑菌作用的物質(zhì)成為發(fā)展天然抑菌劑的重要渠道。

鄭曙明等[6]在研究漁用抗菌劑復(fù)方五倍子有效成分及體外抑菌實驗時，通過薄層分析法發(fā)現(xiàn)并得出五倍子中所含的沒食子酸具有較好的抑菌活性。經(jīng)紫外分光光度法測定其量為10.47%，在活性成分中所占比例最大。并測定了其對水產(chǎn)生物常見致病菌柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌、遲緩愛德華菌、豚鼠氣單胞菌的抑菌圈大小，直徑分別為26、28、30、25mm，由此可見沒食子酸是具有明顯抑菌活性的。

5.4 防齲齒的功能

齲齒是指牙齒在多種因素作用下，使組織脫礦、有機質(zhì)分解等，進而導(dǎo)致牙齒損壞的常見口腔疾病[54]。引起齲齒的主要因素是細菌，如乳酸桿菌、茸毛鏈球菌、變形鏈球菌，它們經(jīng)由附著于牙齒表面，產(chǎn)生牙菌斑，致使牙齒破壞。由此可見，抑制或殺死致齲細菌是預(yù)防齲齒的有效途徑。

王人可等[55]采用大鼠齲模型，以含有沒食子酸的五倍子提取物為實驗組，研究了抑齲作用。通過S.sobrinus侵染SPF-SD大鼠建立模型，在對光滑面E級損壞上，與陰性對照組（去離子水）相比，實驗組和陽性對照組（洗必泰和氟化鈉）都表現(xiàn)了較好的抑制作用（抑齲率為43%～61%，p＜0.05），可能是阻礙了致齲菌黏附在被唾液包裹的羥磷灰石上。謝倩等[56]在研究由五倍子總鞣質(zhì)分離得到的4個組分對致齲菌生長的影響時發(fā)現(xiàn)，五倍子沒食子酸具有抑制作用，并通過活菌計數(shù)法測定了五倍子沒食子酸對變形鏈球菌生長的影響，結(jié)果顯示其具有抑制作用，但不能直接殺死細菌，可能是遏制了細菌代謝時需要的酶類的生成。此外，還有研究顯示五倍子沒食子酸對牙齒脫礦釉質(zhì)再礦化具有促進作用[57]，這些都將為發(fā)展新的防齲活性成分奠定基礎(chǔ)，但其在臨床中的抑齲效果還需進一步研究。

常用的防齲藥物，如抗生素類、氟化物，在長時間使用的情況下，可引起口腔菌群失調(diào)或產(chǎn)生耐氟菌、毒副作用等，而五倍子等天然物質(zhì)不僅治療效果明顯、副作用小，并且資源豐富、獲取便利，具有很好的研究價值。

6 展望

沒食子酸作為一種天然多酚類物質(zhì)，可由五倍子單寧水解生成。五倍子作為我國的天然產(chǎn)物，不僅產(chǎn)量大，而且價格低廉，為沒食子酸的生產(chǎn)奠定良好的基礎(chǔ)?？筛鶕?jù)生態(tài)工程建設(shè)，大力發(fā)展這種天然產(chǎn)物資源，其前景是不言而喻的，定會獲得良好的社會及經(jīng)濟效益。隨著社會和科技的發(fā)展，對沒食子酸的需求會越來越大。但是，對于沒食子酸的各種生物活性（如抗氧化、抑菌等）的作用機制的研究還處于淺顯層面，應(yīng)加大在分子和細胞水平的研究，使其產(chǎn)生更大的作用，擁有更廣闊的發(fā)展空間。

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