唐翠娥，彭麗桃，李 頡，孫雙勛，楊書珍，*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070；2.洛陽市食品藥品監(jiān)督管理局，河南洛陽471072）

脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus）是脂環(huán)酸芽孢桿菌屬，革蘭陽性（僅有一株為革蘭陰性）的芽孢桿菌，主要分布于高酸的熱環(huán)境、土壤及水果加工品種，如蘋果、桔子、芒果等[1]。其中，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（A.acidoterrestris）和酸熱脂環(huán)芽孢桿菌（A.acidocaldarius）是導(dǎo)致已滅菌果汁腐敗變質(zhì)的主要微生物，其代謝產(chǎn)物愈創(chuàng)木酚、2，6-二溴苯酚等在極低濃度下（0.01%）就會導(dǎo)致果汁出現(xiàn)口感和風(fēng)味變劣，使澄清果汁出現(xiàn)濁度乃至形成白色沉淀等質(zhì)量問題[2-3]。目前，國際貿(mào)易嚴(yán)格規(guī)定每10mL濃縮果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌數(shù)量不得超過1個[4]。近年來，由脂環(huán)酸芽孢桿菌引起的已滅菌果汁腐敗事件在美國、澳大利亞、日本等相繼大規(guī)模的發(fā)生，已經(jīng)引起了果汁生產(chǎn)企業(yè)及科學(xué)家的廣泛關(guān)注[5]。已有研究表明，脂環(huán)酸芽胞桿菌生長情況與其所處環(huán)境關(guān)系密切，橙汁和梨汁最適合脂環(huán)酸芽胞桿菌的生長，其次是蘋果汁、桃汁、白葡萄汁，而在柚子汁中僅能緩慢生長[6]。在蘋果汁中，當(dāng)溫度低于30℃或可溶性固形物含量高于20°Brix時嗜酸耐熱菌即無法繁殖。因此，研究環(huán)境條件對果汁中的脂環(huán)酸芽胞桿菌生長影響，對進(jìn)一步尋找控制果汁中脂環(huán)酸芽胞桿菌的途徑具有重要意義。目前有關(guān)脂環(huán)酸芽孢桿菌的研究主要集中在新菌株的鑒定和檢測方面，對于果汁中營養(yǎng)成分及加工條件對脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以引起已滅菌果汁常見的病原菌酸土和酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌為研究對象，研究橙汁中的主要營養(yǎng)成分、橙汁濃度及加工條件等因素對兩種果汁中常見的酸熱和酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響，以期為進(jìn)一步尋找脂環(huán)酸芽胞桿菌的控制途徑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（A.acidoterrestris DSM3922）、酸熱脂環(huán)酸芽胞桿菌（A.acidophilus DSM14558） 均購自德國菌種保藏中心；蔗糖、檸檬酸等 為食品級；硫酸銨、氯化鈣、硼酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、無水氯化鈣等 為分析純級，以上試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SB-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；SW-CJ-1G型超凈工作臺 安徽蚌埠凈化設(shè)備廠；SHZ-82型氣浴恒溫振蕩器 江蘇億通電子有限公司；MJ-250BP02A型榨汁機(jī) 廣東美的生活電器制造有限公司；YXQ-SG41-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。

1.2 橙汁的制備

新鮮無損傷的臍橙果實(shí)，采用離心式榨汁機(jī)榨汁，果汁灌裝后密封置于-20℃下保存?zhèn)溆?。濃縮果汁的制備采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對橙汁進(jìn)行濃縮，直到糖度達(dá)到50°brix，滅菌后保存。

1.3 脂環(huán)酸芽胞桿菌的培養(yǎng)及生長量測定

1.3.1 脂環(huán)酸芽胞桿菌的培養(yǎng)基制備 按ATCC提供的1656 BAM-SM培養(yǎng)基配方并添加金屬離子溶液配制成分離培養(yǎng)基。CaCl2·2H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.5g、（NH4）2SO40.2g、KH2PO43.0g、Yeast extract 6g、微量金屬溶液1mL（CaCl2·2H2O 0.66g，ZnSO4·7H2O 0.18g，CuSO4·5H2O 0.16g，MnSO4·4H2O 0.15g，CoCl2·6H2O 0.18g，H3BO30.10g，Na2MoO4·2H2O 0.30g，分別溶于1L滅菌蒸餾水），加入1000mL滅菌蒸餾水，充分?jǐn)嚢枞芙夂笥肏2SO4調(diào)節(jié)pH至4.0，121℃高壓滅菌15min，即為1656 BAM-SM液體培養(yǎng)基。若制備1656 BAM-SM瓊脂平板，先制備雙倍液體培養(yǎng)基（即同溶液體積中各成分加倍，調(diào)pH4.0）和等體積的4%蒸餾水瓊脂，然后為了防止瓊脂被酸化將兩者分別121℃高壓滅菌15min，在無菌條件下將保溫至50℃的雙倍液體培養(yǎng)基和4%蒸餾水瓊脂等體積混合，調(diào)pH至4.0后傾注平板，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 脂環(huán)酸芽孢桿菌在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)及生長量測定 分別向4.5mL已滅菌BAM液體培養(yǎng)基中接入0.5mL脂環(huán)酸芽胞桿菌的菌液，然后在45℃，128r/min的恒溫氣浴搖床上振蕩培養(yǎng)48h，測定脂環(huán)酸芽孢桿菌在培養(yǎng)液中的生長量，以培養(yǎng)液在600nm下的光吸收值表示菌體的生長量。

1.3.3 脂環(huán)酸芽孢桿菌在橙汁飲料中的培養(yǎng)及生長量測定 分別向4.5mL已滅菌的不同濃度的橙汁飲料中接入0.5mL脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌液，然后在45℃，128r/min的恒溫氣浴搖床上振蕩培養(yǎng)48h，測定脂環(huán)酸芽孢桿菌在橙汁飲料中的生長量，脂環(huán)酸芽孢桿菌在橙汁及其飲料中的生長量采用顯微計(jì)數(shù)法測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均表示為三次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)分析采用Excel軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 蔗糖對脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響

蔗糖是橙汁中存在的主要糖類物質(zhì)，賦予橙汁甜味。為了研究蔗糖添加量對脂環(huán)酸芽胞桿菌的影響，本實(shí)驗(yàn)將蔗糖添加到已滅菌的BAM液體培養(yǎng)基中，使蔗糖在培養(yǎng)基中的含量分別達(dá)到0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%。從圖1可以看出，蔗糖對兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響不同。在0%～10%的范圍內(nèi)，蔗糖對酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長具有顯著的促進(jìn)作用，當(dāng)蔗糖濃度大于10%時，酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長呈現(xiàn)下降的趨勢，當(dāng)介質(zhì)中蔗糖濃度高于25%時，酸熱脂環(huán)酸芽胞桿菌的生長受到抑制；蔗糖對酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌沒有表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，當(dāng)蔗糖濃度超過20%時，酸土芽孢桿菌的生長受到抑制。Splittstoesser等[6-7]報(bào)道當(dāng)環(huán)境中可溶性固形物含量超過18°Brix時，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長就會受到抑制，Pe?a和Massaguer在橙汁中也得到類似結(jié)果。因此，環(huán)境中高濃度的蔗糖可以抑制兩種菌的生長，這可能與蔗糖對細(xì)菌的脫水作用有關(guān)。

圖1 蔗糖對脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響Fig.1 Effect of sugar on the growth of Alicyclobacillus

2.2 檸檬酸對脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響

作為橙汁中的主要有機(jī)酸，檸檬酸的存在對橙汁的風(fēng)味具有重要影響。本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度的檸檬酸對酸土和酸熱兩種脂環(huán)酸芽胞桿菌生長的影響。結(jié)果如圖2（a）所示，從本實(shí)驗(yàn)可以看出，檸檬酸對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長有顯著促進(jìn)作用，當(dāng)介質(zhì)中檸檬酸濃度達(dá)到0.1%時，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長量達(dá)最大值，之后下降。檸檬酸對酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌同樣具有促進(jìn)作用，當(dāng)檸檬酸濃度達(dá)0.2%，酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的生物量達(dá)最大。前人研究表明有機(jī)酸的種類對脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長有影響?？箟难嵩跐舛鹊陀?00mg/L時，可以促進(jìn)蘋果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長，當(dāng)濃度高于150mg/L時，會促進(jìn)脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長[8]。Soko?owska等[9]研究表明，不同有機(jī)酸對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌孢子萌發(fā)有抑制作用，其抑制效果依次是：酒石酸＜檸檬酸＜蘋果酸＜琥珀酸＜己二酸＜乳酸＜丙酸，檸檬酸在高濃度（50.0～70.0g/dm3）時，才表現(xiàn)出抑菌效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示檸檬酸的濃度在0%～0.3%之間時（正常果汁中的酸濃度），對脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長具有促進(jìn)作用。

圖2 檸檬酸對脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響Fig.2 Effect of citric acid on the growth of Alicyclobacillus

為了進(jìn)一步研究檸檬酸促進(jìn)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長是否與其提供的酸性環(huán)境有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)分別將含有不同濃度檸檬酸的BAM培養(yǎng)基的pH均調(diào)整為4.0，然后考察不同濃度檸檬酸對脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響，結(jié)果如圖2（b）所示，不同濃度的檸檬酸對兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長幾乎沒有影響。結(jié)合圖2（a）的結(jié)果，推測檸檬酸對兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的促進(jìn)作用可能與其提供的酸性環(huán)境有關(guān)。

2.3 橙汁中主要礦質(zhì)元素對脂環(huán)酸芽胞桿菌生長的影響

橙汁中的礦質(zhì)元素主要是鉀、鎂、鈣，在橙汁中的含量分別是1233.75～1866.23mg/L；77.51～167.15mg/L；49.32～125.29mg/L[10]。本實(shí)驗(yàn)將鉀、鎂、鈣等元素分別添加到BAM液體培養(yǎng)基中，分別使鉀元素的濃度達(dá)到0、500、1000、1500、2000、2500、3000mg/L，鎂元素的濃度達(dá)到0、20、100、150、200、250mg/L，鈣元素濃度達(dá)到0、50、100、150、200、250mg/L，研究這些礦質(zhì)元素對兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響。如圖3（a）所示，鉀元素在低濃度下（0～1000mg/L）可以促進(jìn)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長；當(dāng)濃度超過1000mg/L時，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長受到抑制；在測定濃度范圍內(nèi)，鉀對酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長有促進(jìn)作用，隨著濃度的增加，鉀元素對酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的促進(jìn)作用呈先增加后下降的趨勢，當(dāng)鉀元素的濃度達(dá)到2000mg/L時，菌的生長量達(dá)到最大值，之后下降。由圖3（b）可知，橙汁中鎂的存在可以促進(jìn)兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長。由圖3（c）可知，鈣在低濃度時，對兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長具有促進(jìn)作用，當(dāng)濃度高于200mg/L時，鈣元素的存在會抑制酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長。有研究表明，二價金屬離子鈣能夠通過與酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌孢子中的2，6-吡啶二羧酸（DPA）發(fā)生礦化作用形成Ca-DPA復(fù)合物而增強(qiáng)孢子的穩(wěn)定性和抗熱性[11-12]。本實(shí)驗(yàn)中低濃度的鈣元素可以促進(jìn)脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長，可能與脂環(huán)酸芽孢桿菌產(chǎn)生的礦化作用有關(guān)。

圖3 礦質(zhì)元素對脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響Fig.3 Effect of mineral elements on the growth of Alicyclobacillus

2.4 橙汁濃度對脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響

本實(shí)驗(yàn)測定了兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同濃度橙汁飲料及其濃縮橙汁中的生長情況。從圖4中可以看出，橙汁飲料的濃度對兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌的影響不同。在橙汁濃度為0%～100%的范圍內(nèi)，隨著橙汁濃度的增加，兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長量均呈上升趨勢，當(dāng)果汁濃度達(dá)100%（原果汁）時，環(huán)境中所含有的酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌或酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌數(shù)量最多；而濃縮橙汁中兩種菌的數(shù)量最少。因此，在不同的橙汁及飲料中，橙汁飲料及橙汁原汁能夠促進(jìn)脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長，濃縮橙汁對兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中橙汁濃縮汁的可溶性固形物含量為50°Brix，兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長受到了顯著的抑制作用，生長量僅為對照的20%。但是Silva等[13-14]報(bào)道隨著果汁中干物質(zhì)含量和pH的增加，檸檬汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的D值也隨之增加，同時多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)pH并不是影響果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌D值的關(guān)鍵因素，可能是由于糖對微生物耐熱性起到保護(hù)作用，使?jié)饪s果汁中的脂環(huán)酸芽孢桿菌在短時間內(nèi)很難完全殺死。

圖4 橙汁濃度對脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響Fig.4 Concentration of orange juice on the growth of Alicyclobacillus

2.5 溫度處理對脂環(huán)酸芽胞桿菌生長的影響

溫度處理是果汁生產(chǎn)中常見的加工環(huán)節(jié)，為了研究溫度處理對兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響，本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)BAM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌經(jīng)過不同溫度處理（在-20、4、30、50、70、90、121℃下處理30min）后，觀測菌的生長情況。結(jié)果如圖5所示，兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌經(jīng)-20℃的低溫處理后細(xì)菌生長最好；其次是50℃處理30min；從圖5中也可以看出，兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌對高溫處理具有很強(qiáng)的抗性。經(jīng)90℃處理30min后仍能保持良好的生長狀態(tài)，只有當(dāng)處理溫度達(dá)到121℃時，兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長才停止。這些結(jié)果表明，脂環(huán)酸芽孢桿菌具有很強(qiáng)的耐熱性。脂環(huán)酸芽孢桿菌的耐熱性與其細(xì)胞膜中含有主要由ω-環(huán)己烷脂肪酸組成的高含量的脂肪酸（15%～91%）有關(guān)[15]。此外，脂環(huán)酸芽孢桿菌孢子中熱穩(wěn)定性蛋白和酶、二價金屬離子與2，6-吡啶二羧酸（DPA）產(chǎn)生的礦化作用尤其是鈣離子與DPA產(chǎn)生礦化作用形成的Ca-DPA復(fù)合物有關(guān)[16]。

圖5 溫度處理對脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響Fig.5 Temeperature treatment on the growth of Alicyclobacillus

3 結(jié)論

橙汁中的主要營養(yǎng)成分（蔗糖、檸檬酸及礦質(zhì)元素等）有利于脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長；橙汁飲料中，橙汁含量越高，越容易感染酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌和酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌；但濃縮果汁的環(huán)境不利于兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長。兩種脂環(huán)酸芽孢桿菌桿菌對高溫、低溫處理具有很強(qiáng)的抵抗力，通過溫度處理很難有效的殺滅橙汁中的脂環(huán)酸芽孢桿菌，因此，有必要進(jìn)一步尋求新型的非熱殺菌技術(shù)來控制由脂環(huán)酸芽孢桿菌引起的果汁飲料的質(zhì)量敗壞。

[1]Wisotzkey J D，Jurtshuk P，F(xiàn)ox G E，et al.Comparative sequence analyses on the 16S rRNA（rDNA） of Bacillus acidocaldarius，Bacillus acidoterrestris，and Bacillus cycloheptanicus and proposal for creation of a new genus，Alicyclobacillus gen.nov.[J].International Journal of Systematic Bacteriology，1992，42：263-269.

[2]胡貽椿，岳田利，袁亞宏，等.果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus spp.）的危害及其控制[J].食品科學(xué)，2008，29：87-90.

[3]Casas J，Valverde M T，Marin-Iniesta F，et al.Inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores by high pressure CO2in apple cream[J].International Journal of Food Microbiology，2012，156：18-24.

[4]Yuan Y H，Hu Y C，Yue T L，et al.Effect of ultrasonic treatment on thermoacido-philic Alicyclobacillus Acidoterrestris in apple juice[J].Journal of Food Processing and Preservation，2009，33：370-383.

[5]Smit Y，Cameron M，Venter P，et al.Alicyclobacillus spoilage and isolation-A review[J].Food Microbiology，2011，28：331-349.

[6]Splittstoesser D F，Churey J J，Lee C Y.Growth characteristics of aciduric spore forming bacilli isolated from fruit juices[J].Journal of Food Protection，1994，57：1080-1083.

[7]Pena W E L，Massaguer P R，Zuniga A D G，et al.Modelling the growth limit of Alicyclobacillus Acidoterrestris CRA7152 in apple juice：effect of pH，Brix，temperature and nisin concentration[J].Journal of Food Processing and Preservation，2011，35：509-517.

[8]Cerny G，Duong H A，Hennlich W，et al.Alicyclobacillus acidoterrestris：influence of oxygen content on growth in fruit juices[J].Food Australia 2000，52：289-291.

[9]Soko?owska B，?aniewska-Trokenheim ?，Niezgoda J，et al.Influence of organic acids on germination of spores and further growth of Alicyclobacillus acidoterrestris strains[J].Journal Prace Instytutow i Laboratoriow Badawczych Przemys?u Spoz·ywczego，2009，64：66-76.

[10]牛麗影，胡小松，趙鐳，等.橙汁主要礦質(zhì)元素含量的特征分析[J].光譜學(xué)與光譜分析，2009，29：259-262.

[11]Chang S，Kang D H.Alicyclobacillus spp.in the fruit juice industry：history，characteristics，and currentisolation/detection procedures[J].Critical Reviews in Microbiology，2004，30：55-74.

[12]Yamazaki K，Kawai Y，Inoue N，et al.Influence of sporulation medium and divalent ions on the heat resistance of Alicyclobacillus acidoterrestris spores[J].Letters in Applied Microbiology，1997，25：153-156.

[13]Silva F M，Gibbs P，Viera C，et al.Thermal inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores under different temperature，soluble solids and pH conditions for design of fruit processes[J].International Journal of Food Microbiology，1999，51：95-103.

[14]Edyta Chmal-Fudali，Agnieszka Papiewska.The possibility of thermal inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores in fruit and vegetable juices[J].Biotechnology and Food Science，2011，75：87-96.

[15]Hippchen A，R?ll K，Poralla K.Occurrence in soil of thermoacidophilic bacilli possessing ω-cyclohexane fatty acids and hopanoids[J].Archives of Microbiology，1981，129：53-55.

[16]Jay J M，Loessner M J，Golden D A.Food protection with high temperatures，and characteristics of thermophillic microorganisms[J].Modern Food Microbiology，F(xiàn)ood Science Text Series，2005，5：415-441.