易慶平，李居寧

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門448000）

啤酒質(zhì)量的關(guān)鍵是發(fā)酵菌種，酵母是啤酒的靈魂[1]。酵母菌種的優(yōu)化、培育、篩選工作都被啤酒生產(chǎn)廠家放在非常重要的位置。選育一株耐高酒精度、耐高糖度、高滲透壓，同時(shí)分泌良好風(fēng)味物質(zhì)的酵母菌是高濃釀造啤酒的核心工作。國外部分研究者利用酵母融合技術(shù)選育釀酒菌種，取得了較理想的效果[2]。通過原生質(zhì)體融合，得到的菌株遺傳了親本的許多優(yōu)良性狀，啤酒酵母原生質(zhì)體融合菌株在實(shí)驗(yàn)室的研究較多[3-9]，工業(yè)上的應(yīng)用鮮有報(bào)道[9-11]。在啤酒釀造中，菌種代謝產(chǎn)生的酶催化一系列生化反應(yīng)產(chǎn)生的雙乙酰、乙醛和高級醇等物質(zhì)會影響啤酒口感及質(zhì)量。本研究以選育優(yōu)良的啤酒高濃釀造生產(chǎn)菌株為目的，篩選出發(fā)酵度較高、雙乙酰還原快、凝絮性較好、風(fēng)味較好的酵母菌株為原生質(zhì)體融合的親株，為下一步原生質(zhì)體融合提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米（粳米）、酒花、α-淀粉酶等酶制劑、乳酸、石膏 青島啤酒五公司；澳大利亞大麥芽、加拿大大麥芽 青島啤酒麥芽廠；自行研制大麥復(fù)合糖漿 大麥70%+玉米25%+5%麥芽，根據(jù)青島啤啤酒酵母菌種庫的檔案數(shù)據(jù)，從中挑選S.cerevisiae屬中的優(yōu)質(zhì)的青島啤酒酵母和酒精酵母通過糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、離子抗性實(shí)驗(yàn)、二氧化碳減重實(shí)驗(yàn)、供試菌株發(fā)酵后風(fēng)味物質(zhì)分析及品評，確定以下菌株作為融合親株，見表1。

751分光光度計(jì) 上海分光光度計(jì)廠；電子天平、分析天平、制冰機(jī)、紫外分光光度計(jì) 上海儀器有限公司；啤酒全自動分析儀（Anton Paar）、酸度計(jì)、100L發(fā)酵罐 哈爾濱漢德釀造設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 主要分析方法

發(fā)酵度測定：參考文獻(xiàn)[12]的方法；細(xì)胞的凝聚性的測定：參考文獻(xiàn)[13]的方法；雙乙酰含量的測定：參考文獻(xiàn)[12]的方法；α-氨基氮的測定[14]：茚三酮法。

1.3 操作要點(diǎn)

1.3.1 糖化工藝 糖化工藝的設(shè)計(jì)原則在遵循青島啤酒的生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上提高原麥汁濃度到15°P，具體配方及工藝見表2。

表1 供試菌株一覽表Table 1 The list of test strains

表2 糖化配方Table 2 Glycosylated formula

1.3.2 糖化工藝 糖化工藝的設(shè)計(jì)原則遵循青島啤酒的生產(chǎn)工藝，在此基礎(chǔ)上提高原麥汁濃度到15°P，糖化鍋中澳大利亞大麥與加拿大大麥1∶1配比，糊化鍋中投入25%的粳米，酒花分三次添加，總加入量為0.06%。糖化工藝為：50℃糖化30min，65℃糖化60min，75℃糖化15min，糖化曲線見圖1。

圖1 糖化工藝曲線Fig.1 The curve of saccharification process

1.3.4 發(fā)酵工藝 麥汁冷卻至（8.0±0.5）℃時(shí)進(jìn)罐，滿罐后24h內(nèi)排渣一次；待麥汁自然升溫至9.0～9.5℃發(fā)酵；發(fā)酵待糖度降至4.8～5.2°Bx，升溫至12℃，還原雙乙酰；繼續(xù)糖度降至3.8～4.2°Bx，保持罐壓0.8～1.0kg/cm2，封罐24～48h回收酵母，以后每2d排一次酵母；雙乙酰降至0.05mg/L時(shí)降溫，溫度降至0℃后貯藏7d。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

糖化生產(chǎn)15°P麥汁，分別用供試菌株T1、T2、T3、G4、G6擴(kuò)配后，接入100L發(fā)酵罐發(fā)酵，每天監(jiān)測酵母菌數(shù)量，連續(xù)16d，每天取樣測定雙乙酰含量，連續(xù)14d，發(fā)酵完成后測定發(fā)酵度，測定pH、總酸、酵母凝聚性、α-氨基氮、α-氨基氮同化率。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程酵母數(shù)跟蹤

近代啤酒生產(chǎn)酵母使用代數(shù)低（＜5代），為了縮短發(fā)酵前期酵母的增殖時(shí)間，一般選擇繁殖速度較快的菌株。供試菌株發(fā)酵過程中酵母數(shù)量消長情況見圖2。由圖2可見，T2和G4大約5d時(shí)間達(dá)到最大酵母數(shù)，但是T2的酵母數(shù)只有約45×106個(gè)/mL，之后酵母數(shù)迅速下降。T1和T3的最大酵母數(shù)雖然也只有45×106個(gè)/mL，但是它們達(dá)到最大酵母數(shù)的時(shí)間要比T2遲。G6的最大酵母數(shù)也好于T1、T2和T3，在第8d達(dá)到約50×106個(gè)/mL。從圖2可以看出，G4菌株高峰期酵母數(shù)量明顯高、G6菌株次之。

圖2 供試菌株發(fā)酵過程酵母數(shù)變化曲線Fig.2 The variation curves of yeast on fermentation process

2.2 供試菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)雙乙酰跟蹤分析

雙乙酰作為啤酒的一種風(fēng)味物質(zhì)，其含量多少會影響啤酒的風(fēng)味與質(zhì)量。雙乙酰適量時(shí)將會賦予啤酒特殊風(fēng)味，但是當(dāng)啤酒中雙乙酰含量超過閾值0.1mg/L時(shí)，嚴(yán)重影響啤酒的口感，使啤酒產(chǎn)生一種餿飯味[14]?？刂破【浦械碾p乙酰含量可以通過選育少生成雙乙酰菌株和加速雙乙酰的還原兩種方式實(shí)現(xiàn)。在主發(fā)酵過程有雙乙酰合成和還原的反應(yīng)，選育在主酵期雙乙酰生成量少、還原速度快的菌株，可加速啤酒成熟、縮短后酵期。由圖3可見，G4和G6菌株的雙乙酰生成峰值明顯低于T1、T2和T3，而還原雙乙酰的速度比T1、T2和T3菌株還原速度快。在T1、T2和T3中，T2菌株的雙乙酰生成量最多而還原速度最慢。

圖3 供試菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)雙乙酰變化曲線Fig.3 The diacetyl curve of fermentation experiment of test strains

2.3 待濾酒發(fā)酵度

酵母菌種對糖利用通常用發(fā)酵度來衡量。發(fā)酵度的高低不但決定殘?zhí)呛亢途凭龋瑫r(shí)會影響啤酒的口感和保存期。發(fā)酵過程中只有控制好發(fā)酵度，才能更好地控制影響風(fēng)味的副產(chǎn)物。麥芽汁濃度相同時(shí)，發(fā)酵度低，啤酒爽口程度一般、有甜味；發(fā)酵度太高，啤酒口感淡薄、回味不夠。優(yōu)良菌株的真正發(fā)酵度應(yīng)達(dá)65%～70%[16]。供試菌株發(fā)酵度見圖4，G4和G6的發(fā)酵度在啤酒酵母適宜的發(fā)酵度范圍內(nèi)，其值高于T1、T2和T3，且在這些菌種中，T2的發(fā)酵度最低。

圖4 供試菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)酵度比較Fig.4 The degree fermentation of test strains

2.4 供試酵母菌株發(fā)酵待濾酒分析

啤酒酵母具有凝聚性的特征，是由酵母凝聚基因和外界條件決定，菌種不同凝絮性差異很大。凝聚性好的酵母，主發(fā)酵結(jié)束時(shí)能迅速沉降在發(fā)酵罐底部而便于分離，降低分離酵母能耗，防止酵母長時(shí)間懸浮而自溶。酵母菌株凝絮性強(qiáng)可使后續(xù)工藝簡化、提高酒的清亮度及口感[17]。凝聚性太強(qiáng)的酵母，酵母細(xì)胞沉淀快，發(fā)酵液中的細(xì)胞密度低，發(fā)酵慢導(dǎo)致發(fā)酵度低；酵母的凝聚性太弱，細(xì)胞沉淀慢，發(fā)酵液中的細(xì)胞密度高，發(fā)酵快，發(fā)酵度高，但酵母細(xì)胞難從酒液中分離。因此要求生產(chǎn)菌株的凝絮性適中，使發(fā)酵液既能達(dá)到較高的發(fā)酵度，菌體又易分離。表3中，T1和T2菌株凝聚性好于T3、G4和G6。五種菌株待濾酒的pH和總酸均在正常范圍。

麥汁中α-氨基氮含量過低，必然會導(dǎo)致酵母增殖少，發(fā)酵緩慢，雙乙酰含量增高，高級醇含量升高等一系列技術(shù)質(zhì)量問題。酵母增殖必須有合成細(xì)胞的含氮物質(zhì)存在。酵母對α-氨基氮同化的量隨酵母品種、接種量、麥汁中α-氨基氮的含量及發(fā)酵條件不同而有較大差異。α-氨基氮同化快，同化多，則酵母繁殖多，酵母健壯，發(fā)酵力強(qiáng)。因此通過測定α-氨基氮的同化率可以間接了解酵母的生長發(fā)酵情況。表3表明，G4和G6的α-氨基氮同化率均高于T1、T2和T3，從而使發(fā)酵液中雙乙酰的生成量要少于T1、T2和T3，這個(gè)結(jié)果恰好與圖3結(jié)果相吻合。

表3 供試酵母菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)品評結(jié)果Table 3 The results of fermentation taste of test strains

3 結(jié)論

用青島啤酒酵母T1、T2、T3和高濃酵母G4、G6進(jìn)行100L發(fā)酵，高濃酵母G4和G6發(fā)酵過程中酵母數(shù)變化、雙乙酰變化、發(fā)酵度和α-氨基氮同化率指標(biāo)好于青島啤酒酵母T1、T2和T3。青島啤酒酵母T2菌株凝聚性優(yōu)于T1和T3菌株，其他指標(biāo)都不如T1和T3。因此，確定T1、T3和G4、G6為融合親株，下一步進(jìn)行原生質(zhì)體融合。

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