王 妍，李 楊，江連洲，張雅娜

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

傳統(tǒng)豆制品在加工中易形成乳化體系，其中存在的大豆蛋白與磷脂的交聯(lián)作用對(duì)乳化體系有一定影響。大豆貯藏蛋白主要成分為7S和11S。它們占貯藏蛋白70%左右。7S疏水性氨基酸含量高，11S含硫氨基酸含量高[1]。由于7S球蛋白和11S球蛋白在亞基組成、氨基酸組成等方面均有較大差異，使它們對(duì)大豆蛋白的功能特性產(chǎn)生不同的貢獻(xiàn)[2]。大豆蛋白作為食品工業(yè)中不可或缺的原配料，所具有的各種功能特性不斷被發(fā)現(xiàn)，其中乳化性是較為重要的一種性質(zhì)，其原理是利用蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的親水、親油基，吸附在油-水界面上，形成一層膜，從而阻止油滴的聚集，達(dá)到穩(wěn)定乳化的作用[3]。乳狀液的制備需要乳化劑，近年來，人們對(duì)乳狀液的使用和形成產(chǎn)生很大興趣。大多數(shù)文獻(xiàn)研究了乳狀液的形成，穩(wěn)定及其他性質(zhì)。眾所周知，磷脂可以充當(dāng)乳化劑制備乳狀液，Akhtar和Dickinson用卵磷脂充當(dāng)乳化劑制備復(fù)合乳狀液[4]。Fang和Dalgleish發(fā)現(xiàn)低濃度磷脂可以提高O/W乳狀液穩(wěn)定性[5]，近年發(fā)現(xiàn)溶液中表面窗體頂端活性劑和不同蛋白質(zhì)可以相互作用，形成具有不同特性的蛋白質(zhì)-表面活性劑復(fù)合物[6]。Catharina研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)-磷脂交互作用有利于提高牛乳的熱穩(wěn)定性[7]。Annett Knoth研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)問含有磷脂的乳狀液中加入乳清蛋白時(shí)，乳狀液的粒徑大小和穩(wěn)定性均有變化[8]?；诖蠖沟鞍椎慕M成和結(jié)構(gòu)是影響乳化性的一個(gè)重要因素，該研究通過分離純化出大豆分離蛋白及其主要組分7S及11S球蛋白，對(duì)不同蛋白與磷脂混合形成復(fù)合乳化體系的乳化性及流變性進(jìn)行測(cè)定，從而找出7S、11S對(duì)大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系乳化性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂豆粕 哈高科提供；大豆磷脂 深圳康之源生物有限公司；金龍魚大豆調(diào)和油 超市購(gòu)買；SDS、磷酸鹽 均為分析純。

pH S-25酸度計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；電子分析天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；T18 basic高速乳化均質(zhì)機(jī) 英國(guó)IKA公司；722S分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；微量取樣器 上海榮泰生化工程有限公司；磁力攪拌器、機(jī)械攪拌器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；流變儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白SPI的提取 采用Molina Ortiz等的方法[9]。脫脂大豆粉→攪拌（料液比1∶20，提取時(shí)間2h，25℃）→離心→上清液（2mol/L HCl調(diào)至pH4.5在4℃靜置2h）→離心20min（2000r/min）→沉淀（復(fù)溶于5倍蒸餾水）→冷凍干燥→SPI

1.2.2 7S和11S的提取 7S和11S的提取參考Nagano的實(shí)驗(yàn)方法[10]。脫脂豆粉→提?。?5倍水，2mol/L NaoH調(diào)pH7.5，室溫提取1h）→離心（9000×g 20min）→上清液→加NaHSO3，2mol/L HCl調(diào)至pH6.4，4℃過夜→離心（6500×g，20min，4℃）→沉淀（11S）

↓

上清液→用NaCl調(diào)離子濃度0.25mol/L，2mol/L HCl調(diào)至pH5.0，靜置1h→離心（9000×g，30min，4℃）→上清液→用水稀釋兩倍，2mol/L HCl調(diào)至pH4.8→離心（6500×g，20min，4℃）→7S

1.2.3 7S/11S的確定 采用不連續(xù)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）方法[11]，濃縮膠和分離膠中SDS濃度為0.1%、過硫酸銨濃度為0.075%、四甲基乙二胺（TEMED）濃度為0.075%，聚丙烯酰胺濃度分別為2.5%和10%，濃縮膠中緩沖液濃度為0.125mol/L Tris-HCl（pH6.8），分離膠中緩沖液濃度為0.375mol/L Tris-HCl（pH8.8），貯液槽中緩沖液濃度為0.025mol/L Tris-HCl/0.192mol/L甘氨酸（pH8.3）。用0.0625mol/L Tris-HCl（pH6.8）樣品緩沖液（該緩沖液同時(shí)含有2%SDS、5%2-巰基乙醇、10%甘油、0.002%溴酚藍(lán)）溶解一定量分離蛋白粉，配成濃度為1mg/mL的溶液。超聲波水浴處理45min，在沸水中加熱3min。點(diǎn)樣量為15μL，穩(wěn)壓電壓50V進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行固定、染色、脫色。電泳譜圖采用CS910型薄層掃描儀進(jìn)行掃描后，用ScionImage軟件進(jìn)行處理分析。

1.2.4 大豆基本指標(biāo)測(cè)定 水分及揮發(fā)物含量測(cè)定[12]：GB/T 5009.3-2003，直接干燥法；灰分含量測(cè)定[13]：GB/T 5009.4-2003，灼燒稱量法；粗蛋白含量測(cè)定[14]：GB/T 5009.5-2003，半微量凱氏定氮法。

1.2.5 乳狀液的制備 精確稱取1g樣品，溶解于100mL 0.1mol/L磷酸鈉緩沖溶液中，室溫下1000r/min攪拌1h制備蛋白溶液，取0.1g磷脂溶解于大豆油中，室溫下1000r/min攪拌1h。取15mL攪拌均勻的蛋白溶液與5mL溶有磷脂的大豆油混合，在高速乳化均質(zhì)機(jī)下13500r/min乳化2min后倒入25mL燒杯中。

1.2.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 乳化性的測(cè)定參考Molina等[15]的實(shí)驗(yàn)方法，分別于0、30min時(shí)，在燒杯底部取樣20μL乳狀液與5mL 0.1%的SDS溶液均勻混合，在500nm處測(cè)定其吸光值。

式中：T=2.303；N：稀釋倍數(shù)（250）；C：乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度（g/mL）；φ：乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)（0.25）；A0：0min時(shí)吸光值；A30：30min時(shí)吸光值。

1.2.7 乳狀液黏度的測(cè)定 采用Bohlin-CVO流變儀，4/40椎板，測(cè)定溫度25℃，剪切速率從0.01s-1到100s-1測(cè)定表觀粘度。

1.2.8 粒徑的測(cè)定 采用Malvern激光粒度分析儀測(cè)定粒度分布，測(cè)定溫度25℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆基本指標(biāo)測(cè)定

按照1.2.4方法測(cè)得的大豆基本指標(biāo)，如表1所示。

表1大豆基本指標(biāo)Table 1 Basic index of soybean

2.2 凝膠電泳圖譜分析

大豆7S、11S球蛋白及SPI凝膠電泳圖譜見圖1。通過對(duì)SDS－PAGE譜圖中的譜帶進(jìn)行Scion Image掃描分析，7S的純度達(dá)到78.2%，11S的純度達(dá)到88.7%，SPI中7S和11S比例約為4∶6。

圖1 7S、11S球蛋白及SPI電泳圖譜Fig.1 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of 7S、11S globulin and SPI fractions

2.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性分析

圖2 蛋白-磷脂復(fù)合體系的乳化性Fig.2 The EAI of soybean protein-lec complex emulsions

不同蛋白與磷脂交互形成的復(fù)合乳化體系乳化性及乳化穩(wěn)定性見圖2和圖3。從圖中可看出乳化能力：7S＞SPI＞11S，穩(wěn)定性：7S＞SPI＞11S。蛋白與磷脂相互作用形成一種蛋白質(zhì)-卵磷脂復(fù)合物，7S的疏水氨基酸含量高，在它的表面存在大量的疏水區(qū)，所以它能較快的吸附在油滴的表面，并且在油滴的表面與磷脂形成一種更穩(wěn)定的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。而11S因其內(nèi)部含有亞基間和亞基內(nèi)的二硫健，使氨基酸殘基重排從而降低了吸附在油滴表面的速度。另外11S帶高電荷也是造成吸附延誤的原因。因此7S更易與磷脂形成7S-磷脂復(fù)合物，導(dǎo)致7S-磷脂復(fù)合乳化體系乳化性比11S-磷脂高。有研究證明，7S在任何pH下都比11S有更好的降低表面張力的能力[16]，所以復(fù)合乳化體系的水相添加7S比11S穩(wěn)定性也更好。而SPI-磷脂復(fù)合乳化體系的乳化性和乳化穩(wěn)定性是7S和11S共同作用的結(jié)果。

圖3 蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系的乳化穩(wěn)定性Fig.3 The ESI of soybean protein-lec complex emulsions

2.4 黏度分析

通過流變儀測(cè)得不同蛋白與磷脂交互形成的復(fù)合乳化體系的黏度，見圖4。從圖4中可看出，7S-磷脂復(fù)合乳化體系黏度低于11S-磷脂復(fù)合乳化體系。復(fù)合體系的粘度有兩個(gè)主要影響因素，一是連續(xù)相的濃度，二是連續(xù)相的連續(xù)性。通過乳狀活性的測(cè)定，證實(shí)7S更易與磷脂形成一種蛋白質(zhì)-卵磷脂復(fù)雜物，形成的這種結(jié)構(gòu)破壞了連續(xù)相的連續(xù)性，因此7S與磷脂交互形成的乳狀液體系的黏度最低，11S最高，SPI是7S和11S共同作用的結(jié)果。另一方面，蛋白質(zhì)是高分子體系，溶解后具有一定的凝膠性，使得溶液黏度增加。在中性范圍內(nèi)，大豆蛋白11S蛋白含有18～20個(gè)雙硫鍵，疏水性基團(tuán)也多于7S蛋白，酸性亞基和堿性亞基通過雙硫橋鍵連接，分子所形成的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，也比較牢固，有利于蛋白質(zhì)的膨脹，使得溶液的黏度也隨之增加。

圖4 蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系的流變曲線Fig.4 The flow curves of soybean protein-lec complex emulsions

2.5 粒徑分析

由圖5可看出，粒徑分布曲線都出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，雙峰的出現(xiàn)表明乳狀液的分布不均勻，分散性不是很好，這可能是由于均質(zhì)不均勻造成的。

水相添加7S形成的乳狀液不存在過大的凝聚顆粒，小顆粒液滴的數(shù)量較多，乳狀液的平均粒徑小于11S，可能是磷脂與7S作用后形成的7S-磷脂復(fù)合物比與11S作用后形成的11S-磷脂復(fù)合物能更好的降低界面張力，而且7S比11S有更好的乳化活性，因此促進(jìn)小尺寸的液滴形成。而SPI的粒徑大小由7S和11S共同決定，從粒徑分布曲線可看出其粒徑大小處于7S和11S之間。

圖5 蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系的粒徑分布曲線Fig.5 The particle size distribution of soybean protein-lec complex emulsions

3 結(jié)論

用含有磷脂的大豆油當(dāng)油相，制備乳狀液時(shí)，水相添加物不同蛋白分子對(duì)復(fù)合乳化體系的性質(zhì)影響顯著，當(dāng)水相添加7S時(shí)有助于復(fù)合乳化體系的形成，形成的液滴粒徑較小，黏度較低，形成的復(fù)合乳化體系穩(wěn)定性也比添加11S更好。

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