朱 娜,孟 磊,張培旭,姚 華,金永日,李緒文

(1. 吉林大學(xué) 化學(xué)學(xué)院,長春 130012；2. 吉林省環(huán)境監(jiān)測中心站,長春 130011；3. 聚光科技股份有限公司,杭州 310052)

急性子為鳳仙花科鳳仙花屬植物鳳仙花(ImpatiensbalsaminaL.)的干燥成熟種子,在夏、 秋季果實(shí)成熟而未開裂時(shí)采收,曬干,搓出種子[1]. 急性子微苦、 性溫、 有小毒[2],有破血軟堅(jiān)和消積的功效. 主治經(jīng)閉、 噎膈、 腹部腫塊、 骨哽咽喉和外瘍堅(jiān)塊,在臨床可用于避孕、 終止早孕、 治療食管賁門癌癥和骨質(zhì)增生等[3]. 急性子中含有皂苷、 黃酮、 揮發(fā)油、 萘醌及糖類等成分,其中具有較好抗腫瘤活性的皂苷類化合物含量最高[4-7]. 為得到更多的總皂苷有效組分,本文考察急性子中4種主要皂苷類化合物鳳仙萜四醇苷A,B,C和K,通過優(yōu)化影響總皂苷提取率的幾種因素,建立了急性子總皂苷的最優(yōu)提取條件,為急性子總皂苷藥理作用研究提供了理論依據(jù).

1 儀器與樣品

Aglient1200型高效液相色譜儀;Aglient Eclipse XDB-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱;Alltech2000型蒸發(fā)光散射檢測器;Startorius YDO-OIR型電子天平;TYS-200型粉碎機(jī)(浙江永康紅太陽機(jī)電有限公司);RE-201C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市英峪予華儀器廠);SHZ-CB型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司). 色譜純甲醇(美國Fisher公司);自制二次蒸餾水;回流用試劑均為分析純(北京化工廠).

急性子藥材購自安徽省亳州市,經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)鄧明魯教授鑒定為中藥急性子,實(shí)驗(yàn)前將急性子藥材粉碎過100目篩,混勻得急性子粉末. 對(duì)照品鳳仙萜四醇苷K(化合物H1)、 鳳仙萜四醇苷A(化合物H2)、 鳳仙萜四醇苷B(化合物H3)和鳳仙萜四醇苷C(化合物H4)均為自制,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.4%,99.3%,98.0%,99.7%.

2 測定方法

2.1 液相條件 由于急性子皂苷類化合物在紫外波長范圍內(nèi)無吸收,因此選擇蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行檢測. 高效液相色譜檢測條件為：流動(dòng)相：0～20 min,V(甲醇)∶V(水)=46∶54;20～60 min,V(甲醇)∶V(水)=6∶4;柱溫：t=25 ℃;流速：v=1.0 mL/min;進(jìn)樣量：20 μL. 蒸發(fā)光散射(ELSD)檢測條件為: 漂移管溫度t=91 ℃,載氣流速為2.5 L/min ,放大系數(shù)為1.0,撞擊器模式關(guān).

2.2 對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法 分別稱取對(duì)照品H1～H4各25.0 mg,以V(甲醇)∶V(水)=46∶54溶解并定容至25.0 mL容量瓶中,搖勻,制得混合對(duì)照品溶液. 分別精密量取該標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0,2.0,3.0,4.0,6.0,10.0 mL于10 mL容量瓶中,用V(甲醇)∶V(水)=46∶54定容至刻度,搖勻,配成0.10,0.20,0.30,0.40,0.60,1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液. 分別取上述對(duì)照品溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀,以樣品峰面積的常用對(duì)數(shù)對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量的常用對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸分析. 結(jié)果表明,當(dāng)進(jìn)樣質(zhì)量為2.0～20.0 μg時(shí),化合物H1～H4峰面積的常用對(duì)數(shù)值與進(jìn)樣質(zhì)量的常用對(duì)數(shù)值均呈較好的線性關(guān)系. 對(duì)照品回歸方程分別為：

化合物H1：lgY=1.648 4lgX+4.464 1,r=0.999 5;

化合物H2：lgY=1.566 4lgX+4.600 2,r=0.999 2;

化合物H3：lgY=1.476 9lgX+4.719 0,r=0.999 7;

化合物H4：lgY=1.593 8lgX+4.617 8,r=0.999 7.

2.3 急性子中化合物H1～H4質(zhì)量比的測定 稱取3份2.0 g急性子粉末,分別置于100 mL圓底燒瓶中,用12 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇回流提取5次,時(shí)間均為60 min. 將提取液過濾,合并,減壓濃縮,以V(甲醇)∶V(水)=46∶54定容至10 mL容量瓶中. 按2.1中色譜方法及條件,測定提取物中化合物H1～H4的質(zhì)量比,結(jié)果列于表1.

表1 急性子中H1～H4的質(zhì)量比Table 1 Mass contents of H1—H4 in the seeds of Impatiens balsamina L.

3 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

3.1 提取溶劑的單因素考察 由于急性子皂苷類成分為極性較大的化合物,且化合物熱穩(wěn)定性好,因此選擇極性較大的溶劑進(jìn)行回流提取[8-9]. 本文選擇水、 甲醇和乙醇作為溶劑進(jìn)行單因素考察. 稱取等質(zhì)量急性子粉末,分別用V(液)∶m(料)=8的水、 甲醇和乙醇回流提取3次,將提取液過濾,合并,定容,按2.1中色譜方法和條件用HPLC-ELSD測定提取物中化合物H1～H4的質(zhì)量比,以每克藥材中提取得到的化合物H1～H4的質(zhì)量以及它們的總質(zhì)量(mg/g)衡量提取效果. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 水的提取效果較差;甲醇和乙醇對(duì)H1～H4的提取效果較好,但甲醇毒性較大,因此選擇乙醇作為回流提取溶劑.

3.2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)提取率的影響 稱取急性子粉末2.0 g,共7份,分別用16 mL體積分?jǐn)?shù)為90%,80%,70%,60%,50%,30%,20%的乙醇回流提取3次,回流時(shí)間分別為60,45,30 min. 過濾,合并提取液,減壓濃縮,用V(甲醇)∶V(水)=46∶54定容至10 mL容量瓶中. 過0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液按2.1中色譜條件及方法測定提取物中H1～H4的質(zhì)量比,以每克藥材提取得到的化合物H1～H4的質(zhì)量以及它們的總質(zhì)量衡量提取效果,結(jié)果列于表2.

表2 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)化合物H1～H4提取率的影響Table 2 Effect of extraction rate of compound H1—H4 with different volume fraction of ethanol

由表2可見,當(dāng)φ(乙醇)=60%,70%,80%時(shí),溶劑對(duì)化合物H1～H4的提取率相對(duì)較高且提取率相差較小,因此選擇這3個(gè)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為提取溶劑進(jìn)一步優(yōu)化提取條件.

3.3 提取條件優(yōu)化 在上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上,為確定回流提取的最優(yōu)條件,本文通過正交試驗(yàn)(L933),考察乙醇的體積分?jǐn)?shù)、V(液)∶m(料)和回流次數(shù)3個(gè)因素對(duì)急性子中化合物H1～H4提取率的影響. 試驗(yàn)因素與水平列于表3. 稱取急性子粉末2.0 g,共9份. 按表3中列出的各項(xiàng)正交試驗(yàn)條件進(jìn)行水浴回流提取,按2.1中色譜方法和條件,測定不同提取條件下提取物中化合物H1～H4的質(zhì)量(mg)并計(jì)算提取率(提取率=(實(shí)測值/總質(zhì)量)×100%),進(jìn)一步篩選最佳提取條件. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表4和表5.

表3 (L933)正交試驗(yàn)因素水平Table 3 (L933)Levels of orthogonal test factors

表4 (L933)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 (L933) Results of orthogonal test

由表5可見,本文考察的3種因素對(duì)總皂苷的提取率均影響較小,因此可采用直觀分析法選擇最佳提取工藝. A因素中KA2>KA1>KA3,故選擇A2；B因素中KB1>KB2>KB3,故選擇B1；C因素中KC3>KC2>KC1,故選擇C3. 因此最佳提取工藝為A2B1C3,即：φ(乙醇)=70%,V(液)∶m(料)=6,回流提取4次,回流時(shí)間分別為60,45,30,30 min.

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析*Table 5 Analysis of variance about the results

* F0.01(2,2)=99,F0.05(2,2)=19,F0.1(2,2)=9.

3.4 急性子總皂苷提取工藝的驗(yàn)證 稱取急性子粉末100.0g,共3份,分別置于1 000mL圓底燒瓶中,按3.3中篩選的最優(yōu)化提取條件回流提取,將提取液過濾,合并,減壓濃縮,以V(甲醇)∶V(水)=46∶54定容至100mL容量瓶中,從中移取2mL,用V(甲醇)∶V(水)=46∶54稀釋并定容至10mL容量瓶中. 按2.1中色譜方法及條件,測定提取物中化合物H1～H4的質(zhì)量比,并計(jì)算各化合物的提取率,結(jié)果列于表6.

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of verified test

綜上,本文通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的條件對(duì)總皂苷的提取率為98.19%,明顯高于正交試驗(yàn)結(jié)果,最終確定急性子總皂苷最優(yōu)提取條件為：φ(乙醇)=70%,V(液)∶m(料)=6,回流提取4次,提取時(shí)間分別為60,45,30,30 min.

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