賴 璐，梅 平

（長江大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 荊州434023）

量子點（quantu m dots，QDs）是一種具有獨特光學和電學性質的無機納米材料，具有多元激發(fā)一元發(fā)射、抗光漂白強等特性，因此被廣泛的用于生物醫(yī)學成像［1］、藥物載體［2］、DNA檢測［3］、電子工業(yè)［4］等領域。隨著量子點在生物成像及醫(yī)學診斷等領域的廣泛應用，其生物安全性也引起了人們的關注。為了解量子點的生物安全性，人們從生物大分子［5］、亞細胞器［6］、細胞［7］、原生動物［8－9］等不同生命層次研究了量子點的毒性大小以及致毒機制。蛋白質是生物體內最重要的一類生物大分子，是細胞原生質的主要成分，與核酸一起共同構成了生命體的物質基礎。當分散在生物流體（如血液）中時，量子點的表面可能會吸附蛋白質或其他生物大分子，或者發(fā)生聚集生成不同大小的団簇［10］。這些作用均可能導致蛋白質等生物大分子的結構和功能發(fā)生變化。因此，研究量子點與蛋白質的相互作用顯得非常必要。下面，筆者采用熒光光譜、紫外－可見吸收光譜、圓二色譜、紅外光譜等方法系統(tǒng)地研究了谷胱甘肽（GSH）修飾的Cd Te量子點和人血清白蛋白（HSA）之間的相互作用，探討了相互作用機理與相互作用熱力學參數(shù)，研究了量子點對HSA構象的影響。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

1）試劑 人血清白蛋白（HSA），L－谷胱甘肽（GSH，98%），氯化鎘（99.99%），硼氫化鈉（99%），碲粉（99.999%，約200目）購自Sig ma－Al drich公司。試驗用水均采用Millipore超純水系統(tǒng)進行純化（18.2 mΩ·c m－1）。

2）儀器 TU－1900雙光束紫外－可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；帶恒溫系統(tǒng)的LS－55熒光分光光度計（美國Perkin El mer公司）；J－810圓二色光譜儀（日本Jasco公司）；PB－10 p H計、BS110S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ2200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli－Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 GSH修飾Cd Te量子點的制備

1）Cd前體的制備 稱取0.2 mmol Cd Cl2和0.24 mmol GSH，溶于50 ml超純水。邊攪拌邊逐滴加入1 mol／L Na OH溶液（超純水配制），調節(jié)pH值至8.0。將溶液轉移至三口燒瓶中，采用Schlenk技術抽氣充氣（高純Ar）反復6次，除盡溶液中的O2。

2）Te前體的制備 稱取0.2 mmol Te粉和0.5 mmol NaBH4，置于10 ml的離心管中，加入2 ml超純水，冰水浴下攪拌反應直至成無色透明溶液。

在室溫下，強力攪拌下用注射器向Cd前體中加入0.4 ml新制備的Na HTe溶液（0.04 mmol），［Cd］∶［GSH］∶［Te］＝1∶1.2∶0.2（摩爾濃度比）。將三口燒瓶置于油浴中，冷凝回流不同時間，可得到最大發(fā)射波長不同的Cd Te量子點。

3）純化方法 加入一定量的異丙醇至溶液變渾濁，離心棄上清，重復3次。將離心收集的沉淀置于真空干燥箱中，35℃干燥48 h。再將所得固體溶于磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，用0.22μm過濾頭過濾。最后用0.01 mol／L PBS緩沖液（p H＝7.4）透析。用紫外－可見吸收光譜（UV－vis）、熒光發(fā)射光譜（FL）以及X－射線衍射圖譜（XRD）對合成所得Cd Te QDs進行結構表征。

1.3 熒光光譜試驗

采用熒光滴定法測定不同溫度下（298、304和310 K）Cd Te量子點對HSA的熒光猝滅作用。激發(fā)波長為280n m，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度分別為5.0和10.0n m，記錄研究體系在290～430n m之間的熒光發(fā)射光譜。

1.4 紫外－可見吸收光譜

測定1×10－6mol／L HSA、1×10－6mol／L Cd Te量子點以及Cd Te量子點與 HSA 物質的量之比為1∶1的混合溶液的紫外－可見吸收光譜。

1.5 圓二色譜

測定室溫下各不同體系溶液的遠紫外（260～200nm）圓二色譜。選用池徑為0.1c m的石英比色皿，掃描時間為500nm／min，響應時間為0.5s。HSA與Cd Te量子點的物質的量之比分別為20∶1，10∶1，5∶1。以PBS緩沖液為空白扣除溶劑吸收峰。

2 結果與討論

2.1 Cd Te QDs的表征

圖1為GSH修飾Cd Te量子點的紫外－可見吸收光譜圖及熒光光譜圖。從圖1中可以看出，合成得到的Cd Te量子點有明顯的激子吸收峰，熒光峰位于581.5n m，熒光發(fā)射峰對稱性較好，半峰寬約為50n m。以上結果說明合成得到的Cd Te量子點尺寸分布比較均一、光學性能好。圖2為合成所得Cd Te量子點的固體粉末樣品的XRD表征。由圖2可知，Cd Te QDs的衍射譜圖與體相立方形Cd Te的衍射峰相近（PDF No.15－0770）。合成產物在2θ（入射角）＝24.0°、39.8°和47.0°處有3個明顯的衍射峰，分別對應于立方晶系Cd Te的（111）、（220）和（311）3個晶面，說明合成所得Cd Te量子點有比較好的晶形結構［11］。XRD衍射峰的寬化說明Cd Te量子點的粒徑比較小。

圖1 GSH－CdTe量子點的紫外－可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜圖（激發(fā)波長為400n m）

圖2 GSH－CdTe量子點的X－射線衍射圖譜

2.2 熒光猝滅機理和猝滅常數(shù)

熒光是電子從高能級軌道躍遷回低能級軌道時所引起的光子發(fā)射過程，各種分子間的相互作用會導致熒光的猝滅，包括激發(fā)態(tài)的反應、能量轉移、基態(tài)復合物的生成以及碰撞引起的猝滅［12］。根據(jù)猝滅常數(shù)與溫度的關系或者通過測定熒光壽命，猝滅機理通常被區(qū)分為動態(tài)猝滅或者靜態(tài)猝滅。具體而言，動態(tài)猝滅取決于擴散過程，溫度升高粒子的擴散速度越快，因此猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增加。相反，溫度升高會導致復合物的穩(wěn)定性下降，因此靜態(tài)猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減?。?2］。圖3為量子點對HSA的熒光猝滅圖譜。從圖3中可以看出，以280n m的激發(fā)光激發(fā)時，HSA在340n m處出現(xiàn)較強的熒光發(fā)射峰，而量子點在此處沒有熒光發(fā)射。隨著量子點的加入，HSA的熒光隨之逐漸降低。對于熒光猝滅，熒光強度的降低通?？梢杂媒浀涞腟ter n－Vol mer方程［13］描述：

式中，F(xiàn)0和F分別為未加入猝滅劑量子點和加入猝滅劑后的HSA的熒光強度；Ksv為Ster n－Vol mer猝滅常數(shù)；［Q］是猝滅劑的濃度。根據(jù)式（1），以F0／F對［Q］作圖，由直線的斜率可求得Ksv。圖4是不同表面修飾量子點在不同溫度下F0／F對［Q］圖。表1為根據(jù)圖4計算所得不同溫度下的猝滅常數(shù)Ksv。由表1中數(shù)據(jù)可知，量子點對HSA熒光的猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減小，這表明量子點與HSA之間形成了復合物，猝滅機理是靜態(tài)猝滅而不是動態(tài)猝滅。

圖3 不同濃度量子點溶液對HSA的熒光猝滅圖

圖4 不同溫度下量子點猝滅HSA內源熒光的Ster n－Vol mer關系圖

表1 不同溫度下量子點猝滅HSA內源熒光的猝滅常數(shù)與結合常數(shù)

為了進一步驗證表面帶負電的量子點對人血清白蛋白的猝滅機制是靜態(tài)猝滅，筆者測定了體系的紫外－可見吸收光譜的變化。動態(tài)猝滅主要由HSA和猝滅劑之間的碰撞或能量轉移引起，所以HSA的紫外－可見吸收光譜不會發(fā)生變化［12］。而靜態(tài)猝滅是由于HSA和量子點之間形成了靜態(tài)復合物，所以會引起紫外－可見吸收光譜的變化。圖5是HSA的紫外－可見吸收光譜圖（曲線a）、量子點－HSA與同濃度量子點紫外－可見差譜（曲線b）。從圖5可以看出，HSA的吸收光譜與其差譜并不重合且有明顯差異，280與220n m處吸收峰的強度明顯下降。因此，Cd Te量子點對HSA的熒光猝滅是個靜態(tài)過程。

對于靜態(tài)猝滅過程，修正的Ster n－Vol mer方程［13］可以用來計算結合常數(shù)Ka：

式中，fa為熒光物質（熒光基團）可接近猝滅劑的部分（分數(shù)）；Ka為有效猝滅常數(shù)，對于靜態(tài)猝滅機理可認為是結合常數(shù)。由式（2）可知與斜率的比值即為結合常數(shù)Ka。圖6為不同溫度下根據(jù)修正Ster n－Vol mer方程擬合的結果，根據(jù)截距與斜率的比值可得到不同溫度下量子點和HSA的結合常數(shù)Ka（見表1）。表1中數(shù)據(jù)表明量子點和HSA的結合常數(shù)Ka隨溫度的升高數(shù)值減小，與靜態(tài)猝滅機制相符。

圖5 量子點紫外－可見吸收光譜圖

圖6 不同溫度下量子點猝滅HSA內源熒光的修正Ster n－Vol mer關系圖

2.3 相互作用力類型

一般而言，內源或外源物與生物大分子之間的相互作用力包括靜電相互作用、氫鍵、范德華力、疏水作用力和抗體結合位點的空間接觸等［14］。Ross和Subra manian總結了判斷有機小分子與生物大分子相互作用力的熱力學法則［15］。為了判斷量子點和人血清白蛋白之間的相互作用力，可通過van’t Hoff方程（3）計算相關的熱力學參數(shù)：

式中，K為反應溫度下的結合常數(shù)；R是摩爾氣體常數(shù)。將l n K對1／T作圖，可得一直線，由直線的斜率和截距可求得ΔH 和ΔS。吉布斯自由能變（ΔG）可由式（4）得到：

表2為量子點和HSA相互作用的相關熱力學常數(shù)。由表2可知，ΔH＜0，ΔS＞0，表明HSA和Cd Te量子點之間的相互作用以靜電作用力為主［15］。

表2 量子點與HSA相互作用的熱力學參數(shù)

圖7 不同濃度量子點存在下HSA的圓二色譜

2.4 QDs對HSA二級結構的影響

為了研究量子點對HSA二級結構的影響，筆者考察了加入不同濃度量子點前后HSA的遠紫外圓二色譜（CD）。在圓二色光譜中，HSA在208和222n m處存在2個負峰，通常被認為是由于α－螺旋結構中的肽鍵n→π＊電子轉移而產生的［16］。圖7是室溫下不同濃度的量子點對HSA圓二色光譜的影響。從圖7中可以看出，隨著量子點的加入，［θ］208和［θ］222的強度降低，這說明蛋白質中的α－螺旋結構含量減少。量子點與蛋白肽鏈上的氨基酸殘基發(fā)生了相互作用，破壞了氫鍵的網(wǎng)絡結構，使蛋白質以更為松散的構象存在［15］。蛋白質的二級結構與其三級結構相關，也與蛋白質的活性有關，蛋白質α－螺旋結構含量的減少意味著HSA生物活性的喪失。為了定量描述量子點對人血清白蛋白不同類型的二級結構數(shù)量的影響，筆者采用SELCON3算法分析了不同QDs濃度下人血清白蛋白的圓二色光譜。表3為未加入量子點和量子點加入之后HSA不同二級結構的百分比。由表3可知，隨著量子點濃度的增加，α－螺旋結構含量下降，而β－折疊和無規(guī)卷曲等結構含量增加。

表3 量子點對HSA二級結構的影響

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