田艷君， 劉海青， 陳 京， 白 波

(1曲阜師范大學，山東曲阜273165;2泰山醫(yī)學院，山東 泰安271000;3濟寧醫(yī)學院，山東濟寧272000)

G蛋白偶聯(lián)受體 (G-protein-coupled receptors，GPCRs)是與G蛋白偶聯(lián)的膜受體，也是目前已知最大的細胞膜受體家族。GPCRs能夠被不同配體所激活，可將激素、神經(jīng)遞質(zhì)、藥物、趨化因子以及光線等多種化學性和物理性細胞外信號轉(zhuǎn)導入細胞內(nèi)，在多種生理活動和病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。GPCRs被認為是高血壓、心力衰竭、帕金森氏綜合癥等多種疾病的藥物治療靶點，市售藥物約50%都是以 GPCRs為靶點的［1］。

G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G-protein-coupled receptor kinases，GRKs)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要由7個成員組成，按發(fā)現(xiàn)時間順序分別命名為GRK1～GRK7，它們擁有共同的功能結(jié)構(gòu)(圖1)，包括1個中心催化區(qū)、1個供底物識別和含有G蛋白信號調(diào)節(jié)蛋白(regulators of G-protein signaling，RGS)樣結(jié)構(gòu)的氨基末端以及1個作用于細胞膜的長度可變的羧基末端［2-3］。RGS區(qū)具有三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)酶活性，能促進GTP(束縛于Gi和Gq的α亞基)的水解，從而緩沖經(jīng)由Gαi和Gαq通路的信號轉(zhuǎn)導［4］。

GRKs是GPCRs信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵負調(diào)節(jié)因子，GPCRs與配體結(jié)合后，除了能促進G蛋白的激活，還可以引發(fā)GRKs參與的GPCRs的磷酸化。GPCRs一旦發(fā)生磷酸化，抑制蛋白(β-arrestins)便會迅速與之結(jié)合，這將大大削弱受體與G蛋白對刺激物的應答作用。這種受體應答作用迅速喪失的現(xiàn)象稱為脫敏(圖2)。近年來的研究表明，GRKs的作用不止是使GPCR脫敏，它們還可以磷酸化非受體底物，如微管蛋白、突觸核蛋白、光傳感因子等［5］。此外，GRKs還可以與信號轉(zhuǎn)導和運輸中的多種蛋白［如Gαq、Gβγ、G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白(GRK-interacting proteins，GIT)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-ki-nase，PI3K)、網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白等］發(fā)生相互作用， 以一種磷酸化非依賴的方式調(diào)節(jié)細胞功能。

Figure 1．The construction features and classification of GRKs［2］．GRKs are multidomain proteins interacting with a variety of cellular proteins．Such interactions determine the different cellular functions of these kinases and also contribute to modulating their activity and subcellular targeting．The figure depicts the regions where the different functional domains and regulatory phosphorylation and interaction sites have been mapped．RGS:regulators of G-protein signalling;CaM:calmodulin;PL:phospholipids;PH:pleckstrin homology;Auto(±):stimulatory or inhibitory autophosphorylation sites．圖1 GRKs的結(jié)構(gòu)特點和分類

Figure 2．Desensitization of GPCRs．GRKs are recruited to，and phosphorylate ligand-occupied GPCRs on the cytoplasmic carboxyl-terminal tail．β-arrestins then recruit to phosphorylated GPCRs with enhanced affinity，thereby creating a platform for blocking recoupling of the dissociated G-protein subunits to the GPCRs，and preventing further receptor activation(ie，desensitization)．GRK:G-protein-coupled receptor kinase;GPCR:G-protein-coupled receptor．圖2 GPCRs的脫敏過程

1 GRKs的分類和分布

已知哺乳動物體內(nèi)的7種GRKs中，GRK1和GRK7分別分布于視網(wǎng)膜的視桿細胞和視錐細胞，介導光信號轉(zhuǎn)導;GRK4僅在小腦、睪丸和腎臟表達;而GRK2、GRK3、GRK5和 GRK6在多數(shù)組織中均有表達［6］。

基于序列同源性的高低和組織表達特異性不同，GRKs可以分為3個亞家族:視紫紅質(zhì)激酶(rhodopsin kinase，RK)亞家族(GRK1 和 GRK7)、β-腎上腺素受體激酶(β-adrenergic receptor kinase，βARK)亞家族(GRK2和 GRK3)和 GRK4亞家族(GRK4、GRK5和 GRK6)，見圖1。

2 GRKs在心臟的表達和分布

研究顯示，GRK2、GRK3和GRK5在健康人的心臟中均有表達，然而GRK4、GRK6和GRK7幾乎檢測不到［7］。其中，由于 C端功能區(qū)的差異，GRK2和GRK3位于胞漿內(nèi)，而GRK5位于細胞膜。這3種GRKs在心臟的表達雖然存在某些共性，但它們是有區(qū)別的、具有調(diào)節(jié)特性的酶。體內(nèi)實驗顯示，GRK3對凝血酶受體和α1B腎上腺素受體(α1B-adrenergic receptor，α1BAR)有特異性，GRK5對血管緊張素Ⅱ受體有選擇性，而GRK2和GRK5在心肌的β-腎上腺素能受體(β-adrenergic receptor，βAR)βAR 系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［7-8］。而且，這些激酶及其受體的細胞分布和亞細胞定位也為GPCR-GRK相互作用的特異性提供了有利條件。

在胚胎形成和心臟發(fā)育過程中，不同的GRKs作用于不同的信號轉(zhuǎn)導通路。敲除GRK2基因小鼠由于嚴重的心臟發(fā)育不全和心力衰竭，一般在胎齡12.5～15.5 d死亡;然而，缺乏GRK3或GRK5的小鼠則能成活，不會出現(xiàn)上述情況［7，9］。這種由于GRK2基因敲除而引起的胚胎致死和心血管損傷表明，GRK2在胚胎形成和心臟發(fā)育中擁有其它GRKs亞型所沒有的特殊的關(guān)鍵功能。

雖然以上3種GRKs在心臟均有分布，但是它們在心臟的各種細胞類型中的分布卻有差異。大鼠心臟的免疫組織化學分析顯示，GRK2在心肌細胞中僅有微弱的表達，主要分布于血管內(nèi)皮細胞;GRK3僅局限于心肌細胞;而GRK5則在心臟的各種類型細胞中均有分布［3］。心肌組織中不同GRKs亞型的分布反映了它們生理學作用底物的偏向性和在心臟病理學中的作用差異性。

3 心臟GRKs水平和功能的調(diào)節(jié)機制

3．1 相互作用蛋白的調(diào)控 如前所述，GPCRs可激活其偶聯(lián)的G蛋白，完成信號轉(zhuǎn)導。例如，βAR激動劑與βAR結(jié)合后激活G蛋白，使 G蛋白解離為Gα和 Gβγ兩部分，這兩部分分別介導不同的信號轉(zhuǎn)導過程。但此過程受GRKs的調(diào)節(jié)。GRKs可使βAR發(fā)生磷酸化，磷酸化的βAR募集β-arrestins，導致βAR脫敏、內(nèi)化。

強效刺激能使 GRKs與Gβγ或活化的 GPCRs結(jié)合。除此之外，GRKs的活性還能被可以牽制其催化活性的其它相互作用蛋白所調(diào)控，其中較為重要的一種是小窩蛋白(caveolin)。小窩蛋白可作為多種信號分子［其中包括β2AR和不同的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)以及G蛋白］的骨架蛋白，還可以幫助限制或區(qū)分信號轉(zhuǎn)導。GRK2可與存在于心臟的不同小窩蛋白亞型產(chǎn)生相互作用，尤其是在細胞膜小窩蛋白富集區(qū)若出現(xiàn)GRK2，小窩蛋白就易于與之產(chǎn)生相互作用。臨床病例報道，心力衰竭病人的心臟內(nèi)，小窩蛋白水平有所降低;并且，小窩蛋白基因敲除小鼠中，心肌肥大和心肌收縮功能障礙的發(fā)病率明顯提高［10］。因此，GRK2-caveolin的相互作用的改變必然對心臟功能有重要調(diào)節(jié)作用。

最近發(fā)現(xiàn)，GRK2的另一個相互作用蛋白是Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)。RKIP被PKC磷酸化后，將會從Raf上轉(zhuǎn)移下來，同時與GRK2的結(jié)合增強［11］。RKIP水平的降低將導致GRK2活性增強，心肌細胞收縮反應性受損。

3．2 鈣離子結(jié)合蛋白的調(diào)控 細胞內(nèi)鈣離子水平的變化與心力衰竭的發(fā)展有明顯相關(guān)性。不同細胞內(nèi)，鈣離子敏感蛋白會與不同的GRKs產(chǎn)生相互作用，從而調(diào)節(jié)后者的活性［2］。GRK5對鈣離子結(jié)合的鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)，即Ca/CaM的存在很敏感，CaM可以阻止GRK5靶向細胞膜，增加GRK5對可溶性底物的活性;相反，GRK2只有在CaM濃度很高時才會受影響。由于GRK5對CaM具有高親和力，在大多數(shù)類型細胞中當GPCR被激活而導致鈣離子濃度升高時，GRK5會優(yōu)先被抑制。

3．3 磷酸化調(diào)控 雖然GRKs可以使多種GPCRs磷酸化，但是GRKs本身也會被多種激酶磷酸化，第二信使依賴的蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)可調(diào)節(jié)多種GRKs的活性和膜靶向性。這種相互作用在心臟疾病中尤為重要，因為在人類心力衰竭中，PKC和PKA的表達都是上調(diào)的［3］。PKC可使GRK2和GRK5磷酸化，但是二者產(chǎn)生的效應不同。GRK2磷酸化后，它對GPCRs的催化活性增強(可能是通過緩解鈣調(diào)蛋白引起的抑制效應);而GRK5磷酸化后，其催化活性顯著降低［2，5］。另一方面，被以與 Gαs偶聯(lián)為主的受體激活的PKA可直接磷酸化GRK2，該磷酸化并不影響GRK2自身的催化活性，而是增強GRK2與Gβγ亞基的結(jié)合，從而促進GRK2與細胞膜結(jié)合，增強其對活化受體的作用［2］。

GPCRs活化也可以引發(fā)非受體酪氨酸激酶的調(diào)節(jié)，如c-Src、MAPK。已有研究證明β2AR受刺激后，c-Src可以直接使GRK2磷酸化，進一步引起β2AR脫敏、內(nèi)化，這一過程依賴β-arrestins招募c-Src的能力［12］。經(jīng)酪氨酸磷酸化的GRK2對多種底物的活性也因此而增強;但從長期效應來看，該磷酸化可以促進對GRK2細胞水平的調(diào)節(jié)。

GRK2的活性還受細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)的調(diào)控。體外和原位實驗均表明，ERK1可以磷酸化GRK2的Gβγ結(jié)合區(qū)。MAPK磷酸化可顯著影響 GRK2和Gβγ的相互作用，從而抑制激酶的易位和對受體底物的催化活性。此外，GRK2被c-Src和MAPK磷酸化還能觸發(fā)后續(xù)的激酶降解。

3．4 轉(zhuǎn)錄和降解的調(diào)控 在一些病理條件下，不同的GRKs mRNA表達水平有所改變。已有研究報道，在主動脈平滑肌細胞，誘發(fā)血管收縮和心肌肥大的試劑(例如佛波醇)可顯著增強GRK2啟動子的活性［3］。相反地，促炎細胞因子，如白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)或干擾素 γ(interferon γ，IFN-γ)，可引起相反的效應。

GRKs穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)對其表達水平的調(diào)控來說是一個重要的機制。GRK2是一個短壽命蛋白，要經(jīng)歷多聚泛素化并且可被c-Src和MAPK磷酸化，通過蛋白酶復合體通路降解［13］。此過程必須在一種穩(wěn)定的包括β-arrestin的亞細胞環(huán)境中進行。

4 心血管疾病中GRKs水平和活性的變化

βARs是維持正常心臟功能的全程調(diào)節(jié)者，在人類心肌細胞，主要是由β1AR和β2AR兩個亞型通過與Gαs偶聯(lián)來介導正性變時、變力、變轉(zhuǎn)導的腎上腺素能效應。在心力衰竭病人心臟中，βAR密度和反應性降低，主要是因為β1AR出現(xiàn)表達下調(diào)。有研究證實，心臟功能性的β3AR(通過Gαi蛋白進行信號轉(zhuǎn)導)在心力衰竭的心肌中的表達是上調(diào)的［14］。

βARs通過激活其偶聯(lián)的G蛋白而發(fā)揮作用。鑒于GRKs調(diào)節(jié)GPCRs信號轉(zhuǎn)導的普遍性，心血管疾病中，βARs出現(xiàn)改變，GRKs相應地發(fā)生變化。尤其值得注意的是，GRK2和GRK5這2種亞型在心臟的表達和活性的改變。在動物的一些心力衰竭實驗模型中，GRK2和GRK5的表達和活性明顯增加。GRK2的表達和活性的增加還與高血壓、心肌肥大和心肌缺血有關(guān)［7，15］。最有趣的是，GRK2 水平常在心力衰竭發(fā)生之前就已經(jīng)增加，當βAR信號和心室功能改善時才恢復正常［16-17］。在高血壓、心力衰竭等病理情形下，GRKs的結(jié)構(gòu)和功能會發(fā)生顯著的改變，因此，GRKs可以作為一種治療靶點和評價心血管功能的潛在生物指標。

GRKs主要通過血管平滑肌上的GPCRs的磷酸化來調(diào)節(jié)血壓。GRKs家族成員中，GRK2、GRK3、GRK4和GRK5對血壓都有影響，尤其是GRK2和GRK5在高血壓癥狀中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。心力衰竭時，βAR信號轉(zhuǎn)導被擾亂，交感神經(jīng)系統(tǒng)受到持續(xù)的刺激，循環(huán)的兒茶酚胺類物質(zhì)增加，結(jié)果導致βARs的脫敏和/或表達下調(diào)。在這一過程中，βARK1(GRK2)的表達也增加，進一步抑制了βAR的信號轉(zhuǎn)導。GRK2和GRK5過量表達會嚴重損害βAR信號轉(zhuǎn)導和β激動劑介導的心肌收縮功能。心力衰竭時，心肌 GRKs的活性提高了2～3倍，并且 GRK2 mRNA水平和蛋白表達水平均顯著增加［18］。在其它如血壓超負荷、心肌缺血和心肌梗塞等心臟病理情形下，也觀察到類似的GRK2活性或表達水平的上調(diào)。此外，應用βARK-ct(βARK的C末端類似物，可競爭性抑制βARK1轉(zhuǎn)位至細胞膜)抑制βARK1活性可使一些心力衰竭動物模型受損的心臟功能得以逆轉(zhuǎn)，增加存活幾率，與βAR阻斷劑具有協(xié)同作用［3，19］。這表明，心力衰竭時 βARK1 表達增加并非保護性機制。與GRK2不同的是，GRK5的一個突變體——GRK5 Leu41起到類似βAR阻斷劑的作用，能夠延緩去甲腎上腺素刺激受體的間隔，具有抑制心力衰竭的作用［18］。

5 結(jié)語和展望

心血管疾病是造成人群死亡的首要原因。可以預計，未來10～20年心血管疾病的患病率和死亡率還將上升。目前，心血管疾病的診斷和防治是世界性研究熱點。在研究這類疾病的病理生理機制時，發(fā)現(xiàn)更為有效的治療靶點具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。

GRKs與其相互作用蛋白的功能復合體(GRK“interactome”)展示了這些激酶對不同的信號轉(zhuǎn)導通路的重要性，GRKs蛋白水平或活性的變化會影響信號轉(zhuǎn)導通路的效率或特征。在病理環(huán)境中，GRKs水平和/或功能的改變是它們正常的合成、降解和調(diào)控失衡的結(jié)果。在不同心臟細胞類型中這些過程的特異調(diào)控還有待進一步詳細研究。另一方面，GRKs功能改變的結(jié)果可以在它們增加的復合體“interactome”中觀測到，此復合體包括Gαq、PI3K和非GPCR底物。這一理論，結(jié)合心血管疾病動物模型的應用可幫助解決以下問題:GRK水平的改變是心血管疾病的正常結(jié)果還是突如其來的因子;GRKs水平的增加是有益的還是有害的(或者取決于疾病階段)。我們可以這樣理解:使用GRKs作為潛在的生物標志是一種新的診斷程序，或者是一種基于GRKs活性、水平或特異相互作用調(diào)控的新的治療策略。