劉清霞， 葉開和， 王婧茹， 葉春玲△， 黃 儀， 張曉琦， 葉文才

(暨南大學(xué)藥學(xué)院1藥理學(xué)教研室，2中藥及天然藥物研究所，中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新藥物研究廣東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632)

番石榴(Psidium guajava L．)為桃金娘科番石榴屬植物，廣泛分布于我國(guó)華南地區(qū)。上世紀(jì)80年代，我國(guó)在進(jìn)行植物藥普查中發(fā)現(xiàn)，民間使用番石榴葉防治糖尿病和肥胖癥有效果，以番石榴葉粗提取物為原料的制劑“消渴降糖膠囊”的臨床療效顯著，但其降血糖的活性成分和作用機(jī)制尚不清楚。本課題組首次發(fā)現(xiàn)番石榴葉總?cè)?total triterpenoids)是番石榴葉中抗糖尿病作用的主要有效部位，并能顯著降低2型糖尿病大鼠的血糖水平，改善胰島素抵抗［1］。積雪草酸(asiatic acid)為五環(huán)三萜類化合物，是番石榴總?cè)频闹饕煞?，已有研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化，抗炎、肝臟保護(hù)和抗糖尿病作用［2-3］。為了深入探討積雪草酸的抗糖尿病作用及其機(jī)制，本研究采用3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型，觀察積雪草酸對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、分化以及胰島素抵抗脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響并探討其抗糖尿病作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1．1 細(xì)胞 3T3-L1前脂肪細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。于含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液中(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，置于37℃、濕度95%、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1．2 藥物與試劑 積雪草酸來源于番石榴的干燥葉，溶劑法純化工藝提取，純度為98%，實(shí)驗(yàn)前用DMSO溶解，4℃保存。馬來酸羅格列酮(rosiglitazone maleate，Ros)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;正釩酸鈉(sodium orthovanadate，Van)購(gòu)自阿拉丁公司;高糖DMEM購(gòu)自Gibco;胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技公司;油紅O購(gòu)自Sigma;葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;游離脂肪酸測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。

1．3 儀器 NU-4750型二氧化碳培養(yǎng)箱(NuAire);TD80-2B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);LAC-110．4型電子天平(Acculab);Model 680酶標(biāo)儀(Bio-Rad);WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

2 方法

2．1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，用含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、濕度95%、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合后，加含有0．5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松和10 mg/L胰島素的高糖DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h后，換為含10 mg/L胰島素的高糖DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h，隨后換用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換液，誘導(dǎo)分化8～12 d后，90%以上呈脂肪細(xì)胞表型可用于實(shí)驗(yàn)。

2．2 MTT法測(cè)定3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103cells/well。設(shè)置空白對(duì)照組(control)、溶媒對(duì)照組(medium)、積雪草酸處理組、羅格列酮(10 μmol/L)對(duì)照組和正釩酸鈉(10μmol/L)對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組給予正常DMEM，溶媒對(duì)照組給予含0．1%DMSO的DMEM，積雪草酸處理組分為3、10、30和100 μmol/L。3T3-L1前脂肪細(xì)胞按照不同處理方法作用48 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20μL，在37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后，吸出舊培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，混勻后置酶標(biāo)儀主波長(zhǎng)為570 nm，副波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)量吸光度值，觀察積雪草酸對(duì)3T3-Ll前脂肪細(xì)胞增殖的影響。增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值－空白對(duì)照組吸光度值)/空白對(duì)照組吸光度值×100%。

2．3 油紅O染色鑒定3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103cells/well，進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。在誘導(dǎo)分化第6 d加入不同濃度的藥物干預(yù)，藥物分組同2．2項(xiàng)，作用48 h后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3次，用10%多聚甲醛固定30 min，棄去固定液，用滅菌水洗3次，加入油紅O溶液染色30 min后棄之，用滅菌水洗3次，顯微鏡下觀察，然后用異丙醇充分溶解染色脂肪細(xì)胞內(nèi)的油紅O，選擇520 nm波長(zhǎng)在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值，觀察積雪草酸對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響。分化率(%)=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值－空白對(duì)照組吸光度值)/空白對(duì)照組吸光度值×100%。

2．4 3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立調(diào)整上述誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞的細(xì)胞密度，轉(zhuǎn)入96孔板中，將其分為對(duì)照組和模型組(model)，對(duì)照組給予普通高糖DMEM培養(yǎng)基，模型組給予含有1μmol/L地塞米松的培養(yǎng)基，孵育96 h后取細(xì)胞上清液，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定細(xì)胞上清液中葡萄糖的含量，用以反映胰島素抵抗的程度。葡萄糖消耗率(%)=(對(duì)照組葡萄糖含量－模型組葡萄糖含量)/對(duì)照組葡萄糖含量×100%。

2．5 藥物對(duì)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞的糖脂代謝的影響 將分化成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103cells/well，建立胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型。確定造模成功后分為空白對(duì)照組、溶媒對(duì)照組、積雪草酸(3、10、30和100μmol/L)處理組、羅格列酮(10μmol/L)對(duì)照組和正釩酸鈉(10μmol/L)對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組給予正常DMEM，溶媒對(duì)照組給予含0．1%DMSO的DMEM。上述各組再分為不加胰島素處理和加胰島素處理(20 nmol/L)。藥物作用48 h后，分別用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞上清液中葡萄糖含量、比色法檢測(cè)游離脂肪酸(free fat acid，F(xiàn)FA)的濃度。FFA抑制率(%)=(空白對(duì)照組FFA含量－實(shí)驗(yàn)組FFA含量)/空白對(duì)照組FFA含量×100%。

2．6 ELISA法測(cè)定脂聯(lián)素分泌 將建模成功的胰島素抵抗脂肪細(xì)胞分為溶媒對(duì)照組(給予含0．1%DMSO的DMEM)、積雪草酸(10、30和100μmol/L)處理組、羅格列酮對(duì)照組和正釩酸鈉對(duì)照組。此外，取分化成熟的正常脂肪細(xì)胞另設(shè)為正常對(duì)照組(control)，其不做任何處理。其它各組藥物作用48 h后，按試劑盒ELISA法檢測(cè)脂聯(lián)素含量。

2．7 Western blotting法測(cè)定過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)蛋白表達(dá) 收集藥物處理后的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用冰PBS清洗3次，加入150 μL含PMSF的RIPA裂解液，于冰上裂解10 min，將細(xì)胞刮下收集到EP管中。12 000×g、4℃離心10 min，取上清，通過Bio-Rad蛋白實(shí)驗(yàn)進(jìn)行總蛋白定量。以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，然后濕轉(zhuǎn)法(200 mA、1．5 h)將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后。加Ⅰ抗孵育4℃過夜，PBST清洗3次后加Ⅱ抗，37℃孵育1 h，PBST洗3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)，X線壓片曝光，采用WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件Gelpro32來分析膠片中的蛋白條帶。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS19．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析(One-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 積雪草酸對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、分化的影響

與溶媒對(duì)照組相比，積雪草酸在濃度10～100 μmol/L時(shí)能顯著促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖(P＜0.05或P＜0.01)，在濃度100μmol/L時(shí)其增殖提高率達(dá)24．1%;同時(shí)，明顯抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化(P＜0.05或P＜0.01)。陽性對(duì)照藥羅格列酮和正釩酸鈉的結(jié)果則表現(xiàn)為在顯著促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的同時(shí)促進(jìn)其分化(P＜0.01)，見表1。

表1 積雪草酸對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響Table 1．Effects of asiatic acid on the proliferation and differentiation in 3T3-L1 preadipocytes(Mean±SD．n=6)

2 胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的建立

在地塞米松作用下，脂肪細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中葡萄糖的攝取減少，導(dǎo)致模型組的葡萄糖消耗率比溶媒對(duì)照組明顯減少(減少44．2%，P＜0.01)，說明胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞模型建立成功，見圖1。

Figure 1．The changes of glucose uptake in insulin-resistant adipocytes．Mean ± SD．n=6．＊＊ P ＜ 0.01 vs medium group．圖1 胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取情況

3 積雪草酸對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗和游離脂肪酸產(chǎn)生的影響

與溶媒對(duì)照組相比，無論在基礎(chǔ)狀態(tài)還是胰島素刺激狀態(tài)，積雪草酸在濃度30μmol/L和100 μmol/L時(shí)均顯著促進(jìn)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗(P＜0.05);同時(shí)，其顯著減少胰島素抵抗細(xì)胞游離脂肪酸的產(chǎn)生，與溶媒組比較差異顯著(P＜0.05)。陽性對(duì)照藥羅格列酮和正釩酸鈉的結(jié)果與積雪草酸相似，均顯著促進(jìn)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗，減少游離脂肪酸的產(chǎn)生(P＜0.01)，見表2。

表2 積雪草酸對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗和游離脂肪酸產(chǎn)生的影響Table 2．Effects of asiatic acid on glucose uptake and FFA production in insulin-resistant adipocytes(Mean±SD．n=6)

4 積雪草酸對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素分泌的影響

脂肪細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗后，其脂聯(lián)素分泌較正常對(duì)照組顯著減少(P＜0.01);與溶媒對(duì)照組相比，羅格列酮能顯著增加胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素分泌(P＜0.01);而積雪草酸和正釩酸鈉對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素分泌則無明顯升高作用(P＞0.05)，見表3。

表3 積雪草酸對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素分泌的影響Table 3．Effects of asiatic acid on adiponectin secretion in insulin-resistant adipocytes(Mean±SD．n=6)

5 積雪草酸對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的PPARγ和PTP1B蛋白表達(dá)的影響

藥物作用48 h后，與溶媒對(duì)照組相比，積雪草酸和正釩酸鈉對(duì)PPARγ蛋白表達(dá)無明顯影響(P＞0.05)，但能顯著下調(diào)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞PTP1B蛋白的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01)。羅格列酮?jiǎng)t相反，其能顯著上調(diào)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)(P＜0.01)，但對(duì)PTP1B蛋白表達(dá)則無明顯影響(P ＞0.05)，見圖2、3和表4。

Figure 2．Effects of asiatic acid on the expression of PPARγ in insulin-resistant adipocytes．1:medium group;2 ～ 4:asiatic acid(10，30 and 100 μmol/L)groups，respectively;5:Ros(10μmol/L)group;6:Van(10 μmol/L)group．圖2 積雪草酸對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的PPARγ蛋白表達(dá)的影響

Figure 3．Effects of asiatic acid on the expression of PTP1B in insulin-resistant adipocytes．1:medium group;2 ～4:asiatic acid(10，30 and 100 μmol/L)groups，respectively;5:Van(10μmol/L)group;6:Ros(10 μmol/L)group．圖3 積雪草酸對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的PTP1B蛋白表達(dá)的影響

表4 積雪草酸對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的PPARγ和PTP1B蛋白表達(dá)的影響Table 4．Effects of asiatic acid on the expression of PPARγ and PTP1B in insulin-resistant adipocytes(Mean±SD．n=6)

討 論

胰島素抵抗是2型糖尿病重要的發(fā)病機(jī)制之一，貫穿2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展全過程［4］。脂肪組織是胰島素作用的主要靶組織，其糖脂代謝異常在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［5］。正常情況下白色脂肪組織以脂肪的形式儲(chǔ)存過量能量，一旦能量攝取持續(xù)超過能量消耗時(shí)，脂肪組織不僅體積擴(kuò)增肥大，而且脂肪細(xì)胞數(shù)量增多。肥大的脂肪細(xì)胞會(huì)分泌多種脂肪因子，如腫瘤壞死因子α、瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素等以直接干預(yù)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而過度分泌的FFA及某些脂肪因子可以進(jìn)一步影響其它組織對(duì)胰島素的敏感性，也對(duì)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響其胰島素的合成和分泌，加重糖脂代謝的紊亂。

3T3-L1前脂肪細(xì)胞系在胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的刺激下，具有分化為成熟脂肪細(xì)胞的能力，是目前國(guó)際上研究胰島素抵抗、肥胖及體外脂肪細(xì)胞分化的常用工具［6］。為此，本實(shí)驗(yàn)選用地塞米松誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，發(fā)現(xiàn)積雪草酸顯著增加胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗和減少游離脂肪酸的產(chǎn)生，表明積雪草酸對(duì)胰島素抵抗具有明顯的改善作用。

PPARγ是一種在脂肪組織發(fā)育和功能中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。激活PPARγ能促進(jìn)前脂肪細(xì)胞增殖和分化，增加對(duì)胰島素敏感的小脂肪細(xì)胞的數(shù)量，減少游離脂肪酸的產(chǎn)生，提高脂肪細(xì)胞胰島素敏感性，并最終改善胰島素抵抗。以PPARγ為靶點(diǎn)的噻唑烷二酮類藥物(如羅格列酮)早已作為胰島素增敏劑被廣泛應(yīng)用。脂聯(lián)素作為近年發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子之一受到廣泛關(guān)注，具有改善糖脂代謝、增加機(jī)體胰島素敏感性，改善胰島素抵抗等作用［7］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，積雪草酸促進(jìn)前脂肪細(xì)胞增殖，增加胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖利用，降低游離脂肪酸產(chǎn)生，該結(jié)果與羅格列酮相似。但是，對(duì)前脂肪細(xì)胞分化的影響則相反，羅格列酮表現(xiàn)為促進(jìn)，而積雪草酸則表現(xiàn)為抑制作用。此外，羅格列酮能明顯增加胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素水平，但積雪草酸和正釩酸鈉則未有此作用。由此我們分析推測(cè)，積雪草酸改善胰島素抵抗的作用機(jī)制可能不同于羅格列酮。

胰島素抵抗可以發(fā)生在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)。蛋白酪氨酸磷酸酶在胰島素作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用，其中PTP1B的作用尤其顯著。PTP1B主要分布于細(xì)胞漿內(nèi)，胰島素與受體結(jié)合后，促使胰島素受體β亞單位和胰島素受體底物1的磷酸酪氨酸殘基去磷酸化，負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下調(diào)［8-9］。越來越多的證據(jù)表明:PTP1B通過去磷酸化作用影響了胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)胰島素抵抗和肥胖的發(fā)生起重要作用［10-11］。PTP1B抑制劑可抑制胰島素受體的去磷酸化，從而延長(zhǎng)和擴(kuò)大胰島素關(guān)鍵性早期信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，尋找高效特異性的PTP1B抑制劑為治療2型糖尿病和肥胖開辟了新的途徑。正釩酸鈉是公認(rèn)的PTP1B抑制劑，故本實(shí)驗(yàn)選擇它作為陽性對(duì)照藥之一，結(jié)果發(fā)現(xiàn)積雪草酸與正釩酸鈉作用相似，在提高胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的葡萄糖利用、減少游離脂肪酸產(chǎn)生的同時(shí)，對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素分泌以及PPARγ蛋白表達(dá)無明顯影響，但可下調(diào)PTP1B蛋白表達(dá)。因此，我們推測(cè)，下調(diào)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子PTP1B，促進(jìn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能是積雪草酸改善胰島素抵抗的主要機(jī)制。