張 鈺， 韋 紅， 周劍芳， 于在江， 舒躍龍△

(1重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院新生兒診治中心，重慶400014;2中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，病毒基因工程國家重點實驗室，北京100052)

既往流感大流行［1］以及季節(jié)性流感［2］統(tǒng)計資料顯示，相對于正常非孕婦女，孕婦感染流感病毒后更易發(fā)展為重癥病例甚至死亡。孕期感染流感病毒對母親及發(fā)育中的胎兒均可造成負面影響，增加孕婦發(fā)生不良妊娠結(jié)局的風險性［1］。此外，孕婦感染流感病毒后機體免疫狀態(tài)與宮內(nèi)微環(huán)境的改變，可損害發(fā)育中胎兒的器官結(jié)構(gòu)或功能，目前此方面的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)［3］，國內(nèi)外尚無孕期流感病毒感染對后代肺發(fā)育影響的報道。

肺表面活性物質(zhì)是由肺泡Ⅱ型上皮細胞和無纖毛的支氣管與細支氣管上皮細胞(Clara細胞)分泌的磷脂類和蛋白質(zhì)的復雜混合物，具有降低肺泡表面張力、防止呼氣末肺萎陷的重要作用［4］。肺表面活性蛋白(surfactant protein，SP)-B、-C在肺表面活性物質(zhì)吸附于肺泡氣－液交界面從而發(fā)揮其生理活性的過程中起關(guān)鍵作用，其合成和分泌受發(fā)育階段、激素水平以及環(huán)境因素的調(diào)節(jié)［5］。本研究旨在探討在肺發(fā)育的重要時期母親流感病毒感染對后代小鼠肺組織形態(tài)以及SP-B和SP-C蛋白表達的影響。

材料和方法

1 材料

1．1 動物 孕15 d SPF級BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1．2 病毒 本研究所用病毒為流感病毒A/四川/SWL1/2009 H1N1(簡稱 SC/1)，血凝滴度為128，病毒 TCID50為10－6．95/mL。該病毒分離自中國內(nèi)地首例2009甲型H1N1流感病例，由國家流感中心分離保存。為消除孕鼠死亡、流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)、早產(chǎn)等偏倚因素對實驗結(jié)果的影響，本研究選擇非致死量病毒稀釋液感染孕鼠。

1．3 藥品與主要試劑 小鼠SP-B單克隆抗體(Abcam);兔SP-C多克隆抗體(Santa Cruz);小鼠βactin單克隆抗體(Bioworld);山羊抗兔 IgG抗體(KPL);兔抗小鼠IgG抗體(KPL)。總蛋白提取試劑盒(南京凱基公司);8% ～16%Tris-Gly預制膠(Invitrogen)。

1．4 主要儀器 Olympus BX51顯微鏡，ChemiDoc XRS圖像采集系統(tǒng)(Bio-Rad)。

2 方法

2．1 動物分組與處理 將孕15 d小鼠隨機分為對照組和感染組，每組8只。異氟烷輕度麻醉后，予對照組25μL滅菌PBS滴鼻;予感染組25μL SC/1病毒稀釋液(稀釋至10－3)滴鼻感染。移去分娩后的感染組孕鼠，以正常哺乳期BALB/c小鼠作為代母鼠，防止甲流感染母鼠哺乳對小鼠造成的不良影響。

2．2 標本收集與處理 小鼠出生當天記為P0。分別從各組隨機抽取P0、P4、P7和P14小鼠各10只，腹腔注射10% 水合氯醛(0．3 mL/g)麻醉。剖開胸腔，迅速切取右肺，液氮速凍后凍存于－80℃冰箱用于Western blotting檢測;取左肺放入多聚甲醛固定液中，制作石蠟切片(厚度約4μm)。

2．3 肺組織形態(tài)學觀察 每例標本取連續(xù)的石蠟切片2張，蘇木素－伊紅(HE)染色，光鏡下觀察各組鼠的肺組織病理學改變。每張切片隨機取不重疊的5個視野(×200)，以10個視野的輻射狀肺泡計數(shù)(radial alveolar counting，RAC)和肺泡隔厚度的均值作為該例標本的相應指標測定值。RAC測定參照文獻［6］。

2．4 檢測肺泡Ⅱ型上皮細胞數(shù)量 做SP-C的免疫組化染色，陽性細胞即為肺泡Ⅱ型上皮細胞。采用免疫組化SP法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫室溫封閉內(nèi)源性過氧化物酶10～15 min，0．01 mol/L pH 6．0枸櫞酸緩沖液微波修復抗原，正常山羊血清室溫封閉非特異性抗原20～30 min;滴加兔抗小鼠SP-C多克隆抗體(抗體稀釋度為1∶100)，4℃冰箱孵育過夜，滴加生物素化山羊抗兔IgG室溫孵育30 min，滴加過氧化物酶標記的鏈霉親和素室溫孵育30 min;DAB顯色1～2 min;蘇木素輕度復染，脫水、透明、中性樹膠封片后光鏡下觀察。以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性表達，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。每例標本取2張連續(xù)的石蠟切片，光鏡下(×400)每張切片隨機選取5個視野，應用Image-Pro Plus 6．0圖像分析軟件進行分析，計數(shù)陽性細胞數(shù)，最后取10個視野的平均值作為該例標本的肺泡Ⅱ型上皮細胞數(shù)量。

2．5 Western blotting檢測肺組織SP-B和SP-C 按蛋白提取試劑盒說明書，提取肺組織總蛋白，BCA法蛋白定量。選擇β-actin作為內(nèi)參照;蛋白變性后取10μL待測蛋白按序加樣電泳;電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。TBS液4℃封閉過夜;分別加入Ⅰ抗(小鼠SP-B單克隆抗體，1∶100;兔 SP-C 多克隆抗體，1∶200)37 ℃孵育2 h;分別加入HRP標記的Ⅱ抗(兔抗小鼠IgG抗體，1∶5 000;山羊抗兔 IgG 抗體，1∶5 000)37 ℃孵育1 h。ECL化學發(fā)光，ChemiDoc XRS圖像采集系統(tǒng)采集圖像，采用Quanty One 4．62進行圖像分析后作蛋白相對表達量分析。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS13．0軟件包進行統(tǒng)計分析。對照組和感染組間的比較用t檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 一般情況

用非致死量流感病毒稀釋液滴鼻感染孕鼠后，孕鼠從第2天開始逐漸出現(xiàn)反應遲鈍、精神不振、豎毛、弓背及呼吸急促等癥狀，孕鼠無死亡。無流產(chǎn)、死產(chǎn)或早產(chǎn)。對照組和感染組小鼠出生胎齡分別是(20．50 ±1．08)d和(20．40 ±1．17)d，差異無統(tǒng)計學意義;每窩出生小鼠數(shù)分別是5．50±0．85和5．40±0．97，差異無統(tǒng)計學意義。觀察期內(nèi)后代小鼠無死亡，未見唇周發(fā)紺、氣促、呼吸困難等癥狀。

2 小鼠體重和肺組織重量的變化

隨日齡增加，對照組小鼠體重和肺組織重量逐漸增加。感染組小鼠出生體重明顯減輕［(1．24±0.20)g vs(1．66 ±0．23)g］，其體重雖隨日齡增加呈增加趨勢，但P4、P7和P14體重仍較對照組小鼠輕，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。感染組小鼠肺組織重量在各時點均比對照組小鼠稍重，但差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 各組小鼠體重和肺組織重量比較Table 1．Body weight and lung weight of the offsprings(g．Mean±SD．n=10)

3 肺組織病理學改變

對照組小鼠隨鼠齡增加肺組織發(fā)育逐漸成熟，RAC逐漸增多;肺泡間隔厚度逐漸變薄。感染組小鼠肺間質(zhì)輕度充血、水腫，局灶性肺泡隔增寬，RAC明顯減少(P＜0．05)。SP-C免疫組化染色計數(shù)肺泡Ⅱ型上皮細胞，對照組和感染組之間差異無統(tǒng)計學意義，見圖1、2和表2。

Figure 1．The pathological changes of lung tissues in offspring mice(HE staining， × 200)．A:control group，no significant pathological changes;B:infection group，focal alveolar septal widening with pneumocyte hyperplasia and alveolar cell degeneration．圖1 各組小鼠肺組織的典型病理學改變

Figure 2．Surfactant protein C immunohistochemical staining of lung tissues in offspring mice(SP，×400)．A:control group;B:infection group．圖2 各組小鼠肺組織SP-C的免疫組化染色

表2 各組小鼠RAC和肺泡隔厚度比較Table 2．Radial alveolar counting and thickness of alveolar diaphragm in each group(mean±SD．n=10)

4 肺組織SP-B和SP-C蛋白表達的變化

對照組小鼠肺組織SP-B的表達在P0較高，之后呈逐漸降低的趨勢;SP-C的表達在P0～P7呈升高趨勢，在P7～P14呈下降趨勢。與對照組相比，感染組小鼠肺組織SP-B的表達在P0較低，在其它各時點明顯升高;SP-C的表達水平在P0較高，但在P4、P7和 P14均明顯降低(P ＜0．05)，見圖3。

討 論

母親孕期感染流感病毒可對發(fā)育中的胎兒造成不良影響。本研究結(jié)果顯示妊娠晚期流感病毒感染可造成胎兒的低出生體重(較對照組減輕約23%～27%)，與 Mendez-Fiqueroa等［7］的報道一致。低出生體重是胎兒宮內(nèi)生長受限的標志，是不良宮內(nèi)微環(huán)境的反映，引起胎兒宮內(nèi)生長受限最常見的原因是胎盤功能障礙［8］。Fatemi等［9］研究發(fā)現(xiàn)孕期流感病毒感染可引起胎盤組織結(jié)構(gòu)和多種基因表達異常，說明母親孕期感染流感病毒可能造成胎盤功能障礙，不能向發(fā)育中的胎兒輸送足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，從而影響胎兒生長發(fā)育。此外我們研究發(fā)現(xiàn)，直至P14感染組小鼠體重仍較對照組輕，提示母親妊娠晚期感染流感病毒不僅影響胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育，而且對其出生后的體格生長仍有深遠影響。

導致胎兒體格生長受限的因素也可能同樣地對發(fā)育中的肺組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生負面影響，從而影響胎兒生后的肺功能［10］。在本研究中，感染組小鼠肺間質(zhì)充血、水腫;局灶性肺泡隔增厚，這些病理改變可能是小鼠肺組織重量輕度增加的原因;此外感染組小鼠肺泡發(fā)育程度較低，評價肺泡發(fā)育程度的重要指標RAC在各時點均明顯減少，提示孕期流感病毒感染干擾了后代正常的肺發(fā)育進程。

肺表面活性蛋白的合成與分泌受肺發(fā)育過程中多種復雜因素的調(diào)控，是肺發(fā)育成熟與否的重要標志之一。本研究發(fā)現(xiàn)，隨日齡增加，對照組小鼠肺組織SP-B和SP-C的表達呈動態(tài)變化，提示二者與肺發(fā)育過程密切相關(guān)。與對照組相比，感染組小鼠肺組織SP-B的表達在P0降低，而在其它檢測時點明顯升高，尤以P7升高明顯;SP-C的表達在P0升高，但在其它各時點顯著降低。感染組小鼠SP-B和SPC在P0的表達模式變化可能是呼吸建立的刺激及適應出生后呼吸功能需要的結(jié)果。SP-B表達從P4開始呈增高趨勢，而小鼠肺泡化過程從P3開始［11］，提示在孕期流感病毒感染造成后代小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞的情況下，可能通過上調(diào)肺組織內(nèi)和肺發(fā)育相關(guān)的物質(zhì)如SP-B，以在肺泡化的關(guān)鍵時期發(fā)揮代償作用，增加肺泡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，維持肺的容積，試圖使肺結(jié)構(gòu)或功能恢復正常。這種代償作用在早期短時間內(nèi)表現(xiàn)活躍，至P7出現(xiàn)SP-B的表達高峰，之后SP-B表達雖仍較對照組升高，但漸呈下降趨勢，說明這種代償作用是有限的。

SP-C是肺泡Ⅱ型上皮細胞的特異分化標志物，本研究中我們發(fā)現(xiàn)母親孕期流感病毒感染并未影響其后代肺泡Ⅱ型上皮細胞的數(shù)量，因此SP-C表達的減少提示生前病毒感染影響了SP-C合成或分泌的環(huán)節(jié)。研究資料顯示SP-C合成與分泌減少可導致肺泡上皮變性、肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑及纖維化等多種肺組織非特異性病理改變［12］，與多種兒童呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān)［13］。然而我們在研究過程中未見感染組小鼠死亡，且無氣促、呼吸困難等表現(xiàn)，可能是SP-C減少的程度尚不足以引起呼吸功能障礙，也可能是SP-B表達上調(diào)對呼吸功能代償性調(diào)節(jié)的結(jié)果。妊娠晚期流感病毒感染引起的后代小鼠SP-B和SP-C表達模式變化是否會對肺組織結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生深遠影響，以及其具體的影響機制是我們下一步研究的重點。

Figure 3．Western blotting analysis of SP-B and SP-Cprotein expression in lung tissues．A:control group;B:infection group．Mean ± SD．n=10．*P ＜0．05 vs A．圖3 肺組織SP-B、-C蛋白相對表達水平分析