陳 書，魯碧楠，杜子亮，白永飛，德力格瑪，龐宗然

(中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

胰島β細(xì)胞功能受損和胰島素抵抗是2型糖尿病(T2DM)的兩大發(fā)病機(jī)制。糖尿病動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，β細(xì)胞凋亡增加是造成T2DM胰島β細(xì)胞數(shù)量顯著下降的主要原因［1］?！爸拘浴笔侵秆h(huán)以及細(xì)胞內(nèi)(主要是肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島β細(xì)胞)游離脂肪酸(free fat acids，F(xiàn)FAs)濃度過(guò)高，引起β細(xì)胞凋亡、分泌胰島素功能缺陷，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生［2］。中藥菩人丹［3］由苦瓜、人參、丹參、半夏等組成，在調(diào)脂減肥、抑制“脂毒性”、增加胰島素敏感性、減緩T2DM進(jìn)程方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)與潛力。本研究旨在探討菩人丹對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡的抑制及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量300±10 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大鼠胰島素瘤細(xì)胞系INS-1細(xì)胞由大連醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)。

1.2 主要藥品及試劑

苦瓜凍干粉(諾金科生物技術(shù)有限公司)、人參、制何首烏(亞威中藥飲片公司)、丹參、葛根、制水蛭(金香中藥飲片公司)、鹽酸二甲雙胍片(雙鶴藥業(yè))、軟脂酸(Sigma公司)、RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、牛血清白蛋白(Equitech bio公司)、Cell Counting Kit-8(CCK-8)(DOJINDO同仁化學(xué)研究所)、Annexin VFITC＆PI Apoptosis Kit(優(yōu)博奧生物科技有限公司)、細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)、p-IRS2(ser731)(亞諾法生技股份有限公司)、IRS2、p-BAD(ser136)、BAD、p-FOXO1(ser256)(Cell Signaling Technology公司)、FOXO1(Millipore公司)，其他試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)(蘇潔凈化設(shè)備有限公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)分子儀器公司)、熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS有限公司)、電泳儀(Bio-Rad公司)。

1.4 含藥血清制備

取健康雄性Wistar大鼠90只，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分組，30只為菩人丹組，30只為二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組，30只為空白對(duì)照組，各組均飼以普通維持飼料。菩人丹組以煎制中藥溶液灌胃，溶液濃度相當(dāng)于生藥量7.21 g·mL－1，二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組以0.07 g·mL－1二甲雙胍0.5%CMC-Na乳濁液灌胃，空白對(duì)照組以0.5%CMC-Na溶液灌胃。各組大鼠灌胃體質(zhì)量給藥量為10 mL·kg－1，每日給藥2次(間隔12 h)，連續(xù)給藥5 d。第5天首次給藥(即第9次給藥)后1 h，10%水合氯醛(體質(zhì)量劑量3 mL·kg－1)麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血致死。血樣室溫靜置3 h，3500 rpm離心15 min，小心吸取上清，即獲得大鼠血清。將各組大鼠血清混合，經(jīng)56℃水浴滅活30 min，一次性無(wú)菌微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾滅菌，分裝后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

INS-1細(xì)胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)在37℃、5%CO2恒溫濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合后予以傳代。

1.6 分組及給藥干預(yù)

INS-1細(xì)胞于含軟脂酸0.5 mM的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為軟脂酸損傷組(PA)、低劑量菩人丹組(L-PRD)、高劑量菩人丹組(H-PRD)和二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組(metformin，MF)。其中 L-PRD組、H-PRD組和MF組分別給予5%、10%菩人丹和10%二甲雙胍含藥血清干預(yù)24 h，PA組和正常對(duì)照(Control)組則給予RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.7 細(xì)胞活力(cell viability)檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的INS-1細(xì)胞，以1×105cell·mL－1密度接種于96孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度，以Control組OD值為對(duì)照，測(cè)定細(xì)胞活力，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.8 Hoechst熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的INS-1細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞濃度接種于6孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，而后吸去細(xì)胞上清液，每孔先加入1 mL細(xì)胞染色緩沖液，再加入5 μL Hoechst染色液，冰浴或4℃孵育20 min，PBS洗滌1次，置于熒光顯微鏡下(200×)觀察細(xì)胞凋亡(n=5)。

1.9 流式Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集各組干預(yù)后的INS-1細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，同時(shí)以不加AnnexinVFITC和PI的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.10 Caspase-3和caspase-8活性檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的INS-1細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的濃度接種于6孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。將各組INS-1細(xì)胞于600 g，4℃離心5 min收集，吸除上清，PBS洗滌1次，按每200萬(wàn)細(xì)胞加入100 μL裂解液比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min，4℃ 20000 g離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至冰浴預(yù)冷的離心管中，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)caspase-3和caspase-8活性。

1.11 Western blot分析

利用 western blot方法檢測(cè)IRS 2、BAD、FOXO 1蛋白質(zhì)表達(dá)及磷酸化水平。給予PA損傷INS-1細(xì)胞10%菩人丹含藥血清干預(yù)24 h后，收集各組細(xì)胞，RIPA蛋白裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。制備蛋白樣品轉(zhuǎn)膜、封閉置于一抗(p-IRS2 1∶1000、IRS2 1∶1000、p-BAD 1∶5000、BAD 1∶2000、p-FOXO1 1∶1000、FOXO1 1∶2000)中 4℃孵育過(guò)夜。次日置于HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶20000)中室溫孵育40 min。TBST洗膜后，用化學(xué)發(fā)光對(duì)膜進(jìn)行處理，在暗室中曝光、顯影和定影。以Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western印跡目的條帶進(jìn)行掃描，用Quantity One軟件進(jìn)行分析，確定目的條帶和內(nèi)參條帶的光密度值，目的蛋白表達(dá)量的改變用相對(duì)光密度，即目的條帶光密度值與內(nèi)參條帶光密度值的比值來(lái)評(píng)估。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菩人丹對(duì)PA損傷INS-1細(xì)胞活力的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2-1)，PA組INS-1細(xì)胞活力顯著降低，以Control組INS-1細(xì)胞為對(duì)照，其細(xì)胞活力下降至67.9% ±4.06%(P＜0.001)。低劑量菩人丹組(L-PRD)的細(xì)胞活力與PA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(66.4% ±2.11%，P=0.308)，而高劑量菩人丹(H-PRD)使INS-1細(xì)胞活力明顯升高(79.5% ±2.08%，P＜0.001)，與陽(yáng)性對(duì)照藥二甲雙胍(MF)作用效果相當(dāng)(79.5% ±2.26%，P=1.000)。

2.2 菩人丹對(duì)PA損傷INS-1細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行Hoechst 33342染色，熒光顯微鏡下觀察到正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈圓形，顯弱藍(lán)色熒光且細(xì)胞核染色均勻，細(xì)胞凋亡比例(圖2-2)僅為7.00% ±3.29%，而PA組強(qiáng)藍(lán)色熒光著色細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞核呈分葉狀且出現(xiàn)濃染的致密顆粒，凋亡比例達(dá)到32.81% ±2.32%(P＜0.001)。給藥干預(yù)后細(xì)胞凋亡比例有所下降，其中L-PRD組細(xì)胞凋亡減少(30.99% ±1.62%，P=0.093)，與PA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而H-PRD組顯著降低(20.49% ±1.04%，P＜0.001)，與MF陽(yáng)性對(duì)照組作用效果相當(dāng)(20.66% ±2.01%，P=0.866)。此結(jié)果與流式細(xì)胞儀對(duì)各組細(xì)胞凋亡率的分析結(jié)果相一致(圖2-3)，與Control組比較，PA組INS-1細(xì)胞凋亡率顯著升高(30.68% ±1.54%vs.4.86% ±0.40%，P＜0.001)。L-PRD組細(xì)胞凋亡率與PA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(30.00% ±1.20%，P=0.515)，而HPRD組細(xì)胞凋亡率降至21.84% ±1.35%(P＜0.001)，且與 MF組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(22.64% ±2.19%，P=0.445)。

Caspase-3、-8活性檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2-4)，PA使INS-1細(xì)胞caspase-3和caspase-8活性顯著升高，caspase-3活性增加為Control組細(xì)胞的398.21% ±14.11%(P ＜0.001)，caspase-8活性為 Control組的195.93% ±7.73%(P＜0.001)。給藥干預(yù)24 h后，除L-PRD組 caspase-3活性無(wú)明顯降低外(386.62% ±10.10%，P=0.068)，H-PRD組和 MF陽(yáng)性對(duì)照組的caspase-3活性均顯著降低，即H-PRD組降為274.59% ±10.95%(P＜0.001)，MF組降為266.92% ±5.56%(P＜0.001)，二者的作用效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.217)。菩人丹也降低了PA損傷INS-1細(xì)胞的caspase-8的活性，但是L-PRD組caspase-8活性(196.47% ±10.66%)與PA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.917)，而H-PRD則顯著降低了 caspase-8活性(156.77% ±9.44%，P＜0.001)，但與 MF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(136.36% ±7.43%，P=0.001)。

圖2-2 菩人丹抑制PA誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡-Hoechst熒光染色法

2.3 菩人丹對(duì)PA損傷INS-1細(xì)胞IRS2、BAD、FOXO1蛋白質(zhì)表達(dá)及磷酸化的影響

本實(shí)驗(yàn)考察了INS-1細(xì)胞IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)及其絲氨酸731位點(diǎn)(ser731)的磷酸化水平(圖2-5)、BAD(ser136)的磷酸化水平(圖2-6)、FOXO1蛋白質(zhì)表達(dá)及其絲氨酸256位點(diǎn)(ser256)的磷酸化水平(圖2-7)。

與Control組比較，PA使INS-1細(xì)胞的IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降37%(P=0.003)，蛋白質(zhì)磷酸化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，它參與信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控、基因表達(dá)、細(xì)胞周期等諸多細(xì)胞過(guò)程。IRS2絲氨酸位點(diǎn)磷酸化阻止IRS2與胰島素受體結(jié)合，從而干擾胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，PA使INS-1細(xì)胞的IRS2絲氨酸(ser731)位點(diǎn)磷酸化水平升高13.55倍(P＜0.001)，使 BAD(ser136)磷酸化水平下降至74%(P＜0.001)，F(xiàn)OXO1蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高1.43倍(P＜0.001)，F(xiàn)OXO1(ser256)，磷酸化水平顯著降低至86%(P＜0.001)。與PA組比較，菩人丹作用24 h后，INS-1細(xì)胞的IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高 0.9倍(P＜0.001)，IRS2(ser731)磷酸化水平降低2.44倍(P＜0.001)，BAD(ser136)，磷酸化水平升高 2.65倍(P＜0.001)，F(xiàn)OXO1蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降1.61倍(P＜0.001)，F(xiàn)OXO1(ser256)磷酸化水平升高3.83倍(P＜0.001)，且菩人丹的作用趨勢(shì)與陽(yáng)性對(duì)照藥MF一致。

圖2-3 流式Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)INS-1細(xì)胞凋亡

圖2-4 菩人丹對(duì)PA損傷INS-1細(xì)胞caspase-3、-8活性的影響

3 討論

圖2-5 菩人丹對(duì)PA損傷INS-1細(xì)胞IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)及ser731位點(diǎn)磷酸化的影響

IRS是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中極為重要的一類蛋白質(zhì)分子，是胰島素信號(hào)傳遞的中介;IRS 2是發(fā)揮主要作用的胰島素受體底物家族之一，主要負(fù)責(zé)調(diào)控胰島β細(xì)胞的量，即β細(xì)胞的增殖和凋亡等［2］。胰島素與受體結(jié)合后，胰島素受體激酶被激活，被激活的激酶使IRS2酪氨酸磷酸化，通過(guò)多種途徑抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活。然而若IRS出現(xiàn)過(guò)高的絲氨酸位點(diǎn)磷酸化，將阻礙其正常的酪氨酸磷酸化，使其不能發(fā)揮抑制胰島β細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)中，軟脂酸下調(diào)INS-1細(xì)胞的IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)水平，并使其絲氨酸(ser731)位點(diǎn)磷酸化水平升高，而中藥菩人丹上調(diào)IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)水平，并抑制IRS2絲氨酸磷酸化，從而減少β細(xì)胞凋亡，發(fā)揮了其對(duì)脂毒性損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用。

BAD是Bcl-2家族成員之一，受磷酸化/去磷酸化修飾的調(diào)控，可與Bcl-2或Bcl-xl形成復(fù)合體而表現(xiàn)促凋亡活性。生理狀態(tài)下，BAD以磷酸化的形式存在于細(xì)胞之中，并與伴侶蛋白(Chaperone)14-3-3蛋白結(jié)合，阻斷BAD與Bcl-2或Bcl-xl形成二聚體，不干擾 Bcl-2和 Bcl-xl的抑制細(xì)胞凋亡活性，即BAD不能發(fā)揮著促細(xì)胞凋亡作用［4］。而本試驗(yàn)中，軟脂酸使BAD(ser136)磷酸化水平顯著下降，菩人丹則上調(diào)其磷酸化水平，抑制BAD的促細(xì)胞凋亡作用，從而保護(hù)了胰島β細(xì)胞。

圖2-6 菩人丹對(duì)PA損傷INS-1細(xì)胞BAD(ser136)磷酸化的影響

圖2-7 菩人丹對(duì)PA損傷INS-1細(xì)胞FOXO1蛋白質(zhì)表達(dá)及ser256位點(diǎn)磷酸化的影響

FOXO家族的轉(zhuǎn)錄因子穿梭于細(xì)胞核內(nèi)外，在機(jī)體細(xì)胞增殖、凋亡、分化和抵抗氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著重要作用［5］。FOXO1是胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)通路中下游的關(guān)鍵分子，其上游主要受PI3K/Akt控制。有研究顯示，F(xiàn)OXO1參與脂毒性誘β細(xì)胞凋亡，游離脂肪酸培養(yǎng)下的小鼠胰島β細(xì)胞，F(xiàn)OXO1磷酸化水平降低，使FOXO1核內(nèi)轉(zhuǎn)位增加、活性明顯增強(qiáng)，促進(jìn)β細(xì)胞凋亡［6］。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，PA損傷INS-1細(xì)胞FOXO1的ser256位點(diǎn)磷酸化下降，而菩人丹干預(yù)后其磷酸化程度顯著增強(qiáng)，說(shuō)明菩人丹抑制FOXO1的核內(nèi)轉(zhuǎn)位，下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，以保護(hù)脂毒性下的胰島β細(xì)胞。

菩人丹主要由苦瓜、人參、丹參、半夏等藥物組成，其中苦瓜有清暑滌熱、滋養(yǎng)肝腎之功效，研究證實(shí)其活性成分苦瓜皂苷、苦瓜素等降糖作用確切［7］;人參味甘微苦、性溫，大補(bǔ)元?dú)猓堂撋?，現(xiàn)代研究證實(shí)人參皂苷、人參多糖具有良好的降糖效果，且能調(diào)節(jié)脂代謝［8］;丹參味苦微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛之功效，并能有效降低血糖。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參對(duì)細(xì)胞水平的胰島素抵抗病理狀態(tài)進(jìn)展有一定的阻止作用［9］;半夏辛、溫，能燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)，改善痰濕所致的胰島素敏感性下降，諸藥合用共奏養(yǎng)陰清熱、活血化瘀、祛痰化濕之功［10］。前期研究結(jié)果表明，菩人丹可以顯著改善T2DM大鼠的胰島素抵抗、修復(fù)損傷的胰島β細(xì)胞和大血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有降糖調(diào)脂減肥的功效［11，12］。本實(shí)驗(yàn)探究了菩人丹對(duì)PA誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果提示，菩人丹通過(guò)調(diào)控胰島素信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中凋亡相關(guān)蛋白IRS2、BAD、FOXO1的表達(dá)和磷酸化，抑制PA誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用。

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