周 穎，袁 博，馬 越，張 琨，高 峰，王 皓，蘆 晉，吳曉剛，佟 丹，袁長吉

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院放射線科，吉林 長春1300213.吉林省疾病預(yù)防控制中心，吉林 長春 130062）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的40%～50%［1］，目前腦膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)治療為首選，輔以放化療。但由于膠質(zhì)瘤具有侵襲增殖特性，難以做到完全切除，其對(duì)放療不敏感，而化療藥物不易通過血腦屏障，腦膠質(zhì)瘤患者的治療效果往往難以令人滿意，平均生存率不超過1年［2］，因此尋找和研制能透過血腦屏障的抗膠質(zhì)瘤藥物是腦膠質(zhì)瘤治療亟待解決的問題。本研究在建立可模擬膠質(zhì)瘤臨床病理過程穩(wěn)定的動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，對(duì)模型動(dòng)物腦瘤體進(jìn)行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）影像動(dòng)態(tài)觀察及病理形態(tài)學(xué)觀察，選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)間窗，旨在為抗腦膠質(zhì)瘤藥效學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株購自ATCC公司，雄性Wistar大鼠購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK（吉）2008－0005；許可證編號(hào)：SYXK（吉）2008－0011，體質(zhì)量為180～200g。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM（Gibco公司），膠質(zhì)酸性纖維蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（Dako Denmark A／S公司，丹麥），二抗（Abcam公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），10%水合氯醛（按0.3mL·100g－1配置用于腹腔注射麻醉）；CO2培養(yǎng)箱，Olympus倒置顯微鏡，大鼠腦立體定向儀（吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院），1.5T磁共振儀（Simens1.5TAVANTU1.5T超導(dǎo)型磁共振共振儀FR掃描系統(tǒng)）、大鼠專用線圈（Simens公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100U·mL－1青霉素和100U·mL－1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3d換液傳代。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞存活率大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107mL－1，冰浴存放待用。

1.4 模型制作 ①Wistar大鼠術(shù)前12h禁食禁水。②大鼠的麻醉、固定與消毒 ：大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（0.3mL·100g－1）麻醉后，剪去頭頂部毛發(fā)，固定于大鼠立體定向儀上。碘伏消毒，切開頭皮，暴露顱骨。③確定接種部位：取冠狀縫前1mm、矢狀縫左側(cè)3.5mm交點(diǎn)處，用直徑約1mm的微孔鉆鉆孔。④細(xì)胞接種：用50μL微量注射器吸20μL單細(xì)胞懸液，垂直延伸至硬膜下6mm，然后后退1mm，將其細(xì)胞懸液以1μL·min－1速度注入靶區(qū)。除針前停留5min，避免反流。顱骨鉆孔用骨蠟封閉，4號(hào)線皮膚縫合，碘伏消毒。⑤ 細(xì)胞接種完畢后，注意保持大鼠體溫和呼吸道通暢，予側(cè)臥位，保持室內(nèi)溫度，直至大鼠恢復(fù)正?；顒?dòng)和飲食。

1.5 術(shù)后處理 ①大鼠生存狀況觀測(cè)：觀察、記錄大鼠行為改變與生存時(shí)間。②MRI檢查：接種腫瘤的10只大鼠分別于術(shù)后第2、3和4周采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，固定于大鼠頸部線圈上，使用Simens AVANTU1.5T超導(dǎo)型磁共振共振儀FR掃描系統(tǒng)行俯臥橫斷位、冠狀位T1WI掃描。掃描參數(shù)：T1WI采用SE序列；常規(guī)掃描：軸位、冠狀位T1WI（TR／TE＝3070／66ms掃描，F(xiàn)OV＝10cm×10cm，層厚2mm。③病理學(xué)檢查：荷瘤大鼠自然死亡后立即取腦組織，于進(jìn)針處冠狀切開，大體觀察瘤體，并進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查。病理切片及HE染色制作：取材、固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片、HE染色（脫蠟、脫苯、復(fù)水、染色、脫水、透明、封固）、封片。④GFAP檢測(cè)：采用免疫組織化學(xué)法檢查腦腫瘤組織中GFAP的表達(dá)，其陽性表達(dá)說明形成的腦腫瘤具有神經(jīng)膠質(zhì)瘤的特性。

2 結(jié) 果

2.1 荷瘤大鼠生存狀況 大鼠術(shù)后2周出現(xiàn)活動(dòng)和進(jìn)食量減少、皮毛污穢及結(jié)膜充血等表現(xiàn)；3周后，個(gè)別大鼠出現(xiàn)肢體抽搐、偏癱、身體扭曲和自身旋轉(zhuǎn)等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，10只模型動(dòng)物分別于8、10、13、14、15、21、22、23、27和30d死亡。本組荷瘤大鼠中位生存期為18d，平均生存期為（18.3±7.3）d。

2.2 MRI檢查 10只大鼠均可見左側(cè)尾狀核部有新生物生成，T1像呈稍低信號(hào)或等信號(hào)，新生物直徑約5～10mm，邊界較清楚（圖1）。

圖1 大鼠接種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后2（A）、3（B）和4（C）周 MRI動(dòng)態(tài)觀察（T1像）Fig.1 Coronal contrast enhanced（T1－weighted） MRI dynamic scanning images in 2（A），3（B），4（C）weeks after implantation of glioma cells in rats

2.3 病理學(xué)檢查 荷瘤大鼠腦瘤體隨著瘤齡的增加而增大，瘤體大體觀察結(jié)果見圖2。病理學(xué)檢查顯示腫瘤細(xì)胞排列混亂致密，核分裂相易見，腫瘤內(nèi)可見有血管組織增生，腫瘤浸潤性生長呈指狀突入周邊正常組織（圖3，見插頁三）。免疫組織化學(xué)染色顯示：荷瘤大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GFAP陽性表達(dá)。見圖4（插頁三）。

圖2 大鼠C6腦膠質(zhì)瘤大體病理學(xué)表現(xiàn)Fig.2 Macropathological appearence of rat C6glioma

3 討 論

本課題組多年來從事甲基汞所致腦發(fā)育損傷機(jī)制的研究［3－5］。通過長期科研實(shí)踐的積累，推測(cè)氯化甲基汞（MgHgCl）具有治愈腦膠質(zhì)瘤的潛能，提出用MgHgCl治療腦膠質(zhì)瘤的新思路，并通過抗腫瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)其有明顯的抗腫瘤活性［6－10］，并申請(qǐng)國家發(fā)明專利，已獲授權(quán)（ZL 200410010827.7）［11］。本課題組進(jìn)行 MgHgCl抗膠質(zhì)瘤活性和甲基汞－L－半胱氨酸（MMC－L－cys）共軛物通過L型大分子中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（LAT1）增強(qiáng)其靶向轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞毒作用的實(shí)驗(yàn)研究，在進(jìn)行藥物的抗腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究過程中，建立大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型，選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)間窗至關(guān)重要。雖然已有多種膠質(zhì)瘤模型文獻(xiàn)報(bào)道［12－13］，但存在著動(dòng)物種類、細(xì)胞來源、接種方法、位置和接種量的大小等方面差別。本課題組曾采用C6細(xì)胞立體定向移植的方法制作Wistar大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤模型，已成功地建立了大鼠腦膠質(zhì)瘤模型［14］，C6細(xì)胞生長穩(wěn)定，而且在Wistar大鼠中有較好的相容性，可以獲得較高的成瘤率，模型成功率達(dá)100%，并證實(shí)大鼠成瘤后可出現(xiàn)明顯的行為學(xué)改變，有較典型的癥狀。本實(shí)驗(yàn)中免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果顯示：腦腫瘤組織中GFAP陽性表達(dá)，說明形成的腦腫瘤具有神經(jīng)膠質(zhì)瘤的特性；其特點(diǎn)也符合膠質(zhì)瘤的臨床表現(xiàn)。病理學(xué)方面也顯示出腫瘤呈侵襲生長，呈指狀長入瘤周腦組織中，但以往研究未對(duì)荷瘤動(dòng)物腦瘤體進(jìn)行MRI和MRI動(dòng)態(tài)觀察，導(dǎo)致給藥時(shí)間上的盲目性，不能更好地評(píng)價(jià) MgHgCl和MMC－L－cys共軛物抗膠質(zhì)瘤的活性。本研究在以往建立的大鼠C6膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，對(duì)模型動(dòng)物腦瘤體進(jìn)行MRI影像動(dòng)態(tài)觀察，MRI顯示腫瘤生長部位恒定，并隨著瘤齡的增加而增大，選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)間窗（瘤齡2周、瘤體5mm）進(jìn)行抗腦膠質(zhì)瘤藥效學(xué)研究，可更好地評(píng)價(jià)藥物的抗腫瘤活性，亦為其他抗膠質(zhì)瘤藥物的藥效學(xué)研究提供了借鑒。

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