李 園，倪筱莉，汪東琴，朱妙琴

(浙江外國語學(xué)院科學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州310012)

目前，植物提取物中黃酮類物質(zhì)含量的測定一般采用傳統(tǒng)的紫外分光光度法［1］、一階分光光度法［2］、高效液相色譜［3］(High Performance Liquid Chromatography，下文簡稱 HPLC)法和熒光法［4］857-859等.而比色法是一些藥典經(jīng)常采用的測定方法.

HPLC法測定總黃酮含量需要知道所測物中最主要的物質(zhì)成分，且需要相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品進行對照，因而用HPLC法測定植物提取液中總黃酮含量不太容易.紫外分光光度法簡單易行，對設(shè)備要求低，因此它是測定黃酮類物質(zhì)含量最常用的方法.該法在測定過程中會出現(xiàn)一些紅色絮狀的螯合物，影響測定結(jié)果的穩(wěn)定性，因而有必要對其進行優(yōu)化.劉江 和周榮琪［5］76-78將過濾法應(yīng)用到植物提取液中黃酮含量測定，提高了測量結(jié)果的穩(wěn)定性，但操作步驟較麻煩.本文擬比較靜置沉淀法和過濾法對絞股藍茶提取物中黃酮類物質(zhì)測定結(jié)果的影響，從而為改進植物提取液中黃酮類物質(zhì)含量的測定提供依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

儀器:CP1502電子天平，DKS-24電子恒溫水浴鍋，HY-3A多功能振蕩器(江蘇金壇)，UV-1900PPU紫外可見分光光度計.

材料:絞股藍茶(湖南南山)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁化學(xué)有限公司生產(chǎn)的蕓香苷，含量為98%).其它試劑均為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 測定原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

硝酸鋁(Al(NO3)3)顯色法測定黃酮類物質(zhì)含量的原理為:在中性或弱堿性及NaNO2存在的條件下，黃酮類化合物與鋁鹽生成配合物，加入NaOH溶液后顯紅橙色，在510nm波長處有吸收峰且符合比爾定律，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品定量.先用NaNO2還原黃酮，然后加入Al(NO3)3絡(luò)合，最后加NaOH溶液使黃酮類化合物開環(huán)，生成2'-羥基查耳酮而顯色.顯色原理發(fā)生在黃酮醇類成分鄰位無取代的鄰二酚羥基部位，不具有鄰位無取代鄰二酚羥基的黃酮醇類成分加入上述試劑時不顯色［6］.

［5］的方法，用10mL移液管準(zhǔn)確吸取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL 的11.5mg/100mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液分別置于25mL的比色管中.用50%的乙醇溶液補充至約5mL，分別加5%的NaNO2溶液0.3mL，搖勻，放置6min;再加10%的Al(NO3)3溶液0.3mL，搖勻，放置6min，最后加入1mol/L的NaOH溶液4mL，用水稀釋到10mL，放置20min，在510nm處測定過濾前后吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度c(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.2 絞股藍茶提取物中黃酮類物質(zhì)的提取與測定

參考文獻［4］方法，分別稱取2.0g絞股藍茶于錐形瓶中，加入10mL石油醚在200Hz頻率下振蕩30min脫脂、過濾.在濾渣中加入50%的乙醇30mL，振蕩30min，過濾，收集濾液于100mL的容量瓶中.重復(fù)此操作3次，將濾液合并于100mL的容量瓶中，用50%的乙醇定容至100mL備用.按照1.2.1所述方法測定絞股藍茶提取物中黃酮類物質(zhì)含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 過濾前后蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

按1.2.1方法，測得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見表1.

表1 蘆丁濃度與吸光度之間的關(guān)系

過濾前標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程:C1=1.0080A1－0.0066，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9995，式中C1為蘆丁濃度(mg/mL)，A1為吸光度.過濾后的回歸方程:C2=1.2268A2－0.0054，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996.從表1數(shù)據(jù)知，濾紙的吸附作用對結(jié)果有一定影響，蘆丁含量的測定結(jié)果比過濾前偏低.

2.2 重復(fù)性和準(zhǔn)確性的檢驗

用過濾法分別測定了絞股藍茶提取物液中黃酮類物質(zhì)的含量，結(jié)果見表2.

表2 過濾法測定絞股藍茶提取物中類物質(zhì)含量(mg/mL)

由表2可知，測定結(jié)果重現(xiàn)性較好，雖然表格中的數(shù)據(jù)濃度非常低，但是變異系數(shù)也是非常低的，基本能夠滿足定量測定的要求.

另外，分別吸取了1.5mL、2.5mL、3.5mL和4.5mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液加入25mL比色管中，依照過濾法標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，測定了其試液的吸光度，并與按回歸方程:C2=1.2268A2－0.0054得到的計算值一同列入表3中.

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度檢驗

由表3可知，過濾法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度較高，能夠滿足實際的需要.2.

2.3 靜置沉淀法對蘆丁測定的影響

在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)采用過濾法測定吸光度的工作量較大，所耗費的時間較長.觀察到實驗過程中加入NaOH，靜置約30min，螯合物會沉淀于比色管底部這一現(xiàn)象.因而實驗中直接用吸管吸取上層清液來測定吸光度.最后將待測液靜置30min，重新測定各個濃度試液的吸光度，結(jié)果見表4.

表4 蘆丁濃度與吸光度之間的關(guān)系

表4數(shù)據(jù)表明:采用靜置沉淀法，消除了過濾法中濾紙的吸附作用，測定結(jié)果更加準(zhǔn)確.根據(jù)靜置沉淀的吸光度值對應(yīng)蘆丁濃度可以得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好(見圖1).回歸方程為:C3=1.2150A3－0.0060，相關(guān)系數(shù) R2=0.9995.

圖1 靜置沉淀法得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 過濾法和靜置沉淀法測定結(jié)果比較

實驗采用過濾法和靜置沉淀法分別測定了兩份絞股藍茶提取物中黃酮類物質(zhì)含量，結(jié)果見表5.

表5 過濾法和靜置沉淀法測定結(jié)果比較

從表5中數(shù)據(jù)可以看出，過濾法測定結(jié)果比靜置沉淀法測得結(jié)果稍低，可能的原因是濾紙的吸附作用.

3 小結(jié)

(1)過濾法和靜置沉淀法應(yīng)用于紫外分光光度法測定絞股藍茶提取液中黃酮類物質(zhì)含量，可以提高測定的準(zhǔn)確度，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好.

(2)與靜置沉淀法比較，過濾法工作量較大，測定結(jié)果偏低.而靜置沉淀法應(yīng)用于紫外分光光度法測定絞股藍茶提取液中的黃酮類物質(zhì)含量，操作簡單、易行，準(zhǔn)確度更高、穩(wěn)定性更好.

參考文獻:

［1］侯冬巖，回瑞華，關(guān)崇新.絞股藍中總黃酮的分析研究［J］.沈陽師范學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版，2003，22(6):39-42.

［2］李小娟.一階導(dǎo)數(shù)分光光度法測定蜂膠保健品中黃酮的探討［J］.光譜實驗室，2002，19(6):774-776.

［3］Cristea D，Bareau I，Vilarem G.Identification and quantitative HPLC analysis of the main flavonoids present in weld(Reseda luteola L.)［J］.Dyes and Pigments，2003，57(3):267-272.

［4］許剛，張虹，胡劍.竹葉中黃酮提取方法的研究［J］.分析化學(xué)，2002，28(7).

［5］劉江 ，周榮琪.竹葉提取物總黃酮含量測定方法改進［J］.食品科技，2005(7).

［6］張航.云啤2號X大粒麥F2群體籽粒功能成分的遺傳及其QTL分析［D］.昆明:云南大學(xué)，2012:17.