沈穎穎，邵 爽

(浙江外國語學(xué)院科學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州310012)

蛋白質(zhì)-表面活性劑混合體系廣泛應(yīng)用于藥物、化妝品、生物及食品等領(lǐng)域［1-2］.表面活性劑與蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用的研究一直是人們十分感興趣的課題［3-8］，其主要包括表面活性劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化以及相互作用機制;表面活性劑結(jié)構(gòu)、濃度、溶劑、pH值、離子強度和溫度等因素對相互作用的影響等.

離子強度對小分子與生物大分子相互作用存在一定影響.陽離子表面活性劑與血清蛋白通過靜電引力和疏水方式作用，且靜電作用占主導(dǎo)地位，離子強度的變化會直接影響二者作用［9］.離子強度的變化對牛血清蛋白的平衡吸附容量有很大的影響［10］，此外離子強度對BSA的熒光強度影響顯著［11］.

本文在已有研究工作［12-14］的基礎(chǔ)上，通過改變NaCl濃度改變體系的離子強度，用熒光光譜法考察離子強度對新型季銨鹽類離子型表面活性劑N-十四烷基-N-羥乙基-N，N-二甲基溴化銨(THDAB)與牛血清白蛋白(BSA)相互作用的影響，運用理論模型處理實驗數(shù)據(jù)得到猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、平均結(jié)合位點數(shù)等重要相互作用參數(shù)，從而進一步闡明表面活性劑與BSA的結(jié)合機制及作用規(guī)律.

1 儀器和試劑

1.1 儀器

FP-6200型熒光分光光度計(日本Jasco公司);Finnpipette移液器(上海雷勃分析儀器有限公司)5～50μL，20～200 μL;TB-85型超級恒溫器(日本Shimadzu公司);UPWS-10T超純水器(杭州永潔達凈化科技有限公司);AB265-S電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司).

1.2 試劑及配制

BSA購于上海伯奧生物科技有限公司，氮含量≥13.5%;N-十四烷基-N-羥乙基-N，N-二甲基溴化銨(THDAB)為浙江大學(xué)化學(xué)系提供(純度≥99.9%);三羥基氨基甲烷(Tris)(純度≥99.9%)、HCl(濃度為36%～38%)、NaCl(含量≥99.5%)，三者均為分析純;實驗用水為超純水.

配制 pH=7.1 的 Tris-HCl緩沖溶液(分別含0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mol·L－1的 NaCl以改變離子強度)，分別用上述不同離子強度的 Tris-HCl緩沖溶液配制4.0μmol·L－1BSA 溶液及1.0×10－3mol·L－1THDAB溶液備用.

1.3 實驗方法

BSA熒光激發(fā)和發(fā)射光譜測定:用移液器移取一定濃度BSA溶液于石英比色皿中，設(shè)置發(fā)射波長為280nm，狹縫寬度為5nm，在298K下掃描250～350 nm的熒光激發(fā)光譜，測得其最大激發(fā)波長;并在其最大激發(fā)波長處，同樣條件下掃描其290～410nm的熒光發(fā)射光譜，得到最大發(fā)射波長.

THDAB對BSA的熒光猝滅光譜:分別移取含不同NaCl濃度的BSA溶液與不同濃度的THDAB溶液于容量瓶中，混均、恒溫至298K，設(shè)置熒光激發(fā)和發(fā)射最大寬度均為5nm，最大激發(fā)波長為282nm，測定其熒光發(fā)射光譜，記錄最大熒光強度.

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜

分子中色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)等氨基酸殘基可吸收270～300nm紫外光產(chǎn)生熒光，從而成為內(nèi)源性熒光物質(zhì).BSA的內(nèi)源熒光主要由Trp產(chǎn)生，其熒光最大激發(fā)波長在282nm附近.實驗測得4μmol·L－1BSA的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜示于圖1，得到BSA的最大激發(fā)波長為282nm，在此激發(fā)波長下其發(fā)射光譜的最大波長為345nm.

圖1 BSA的激發(fā)和發(fā)射光譜

2.2 猝滅光譜

當NaCl濃度為0.2mol·L－1時，THDAB-BSA的熒光猝滅光譜見圖2，其它不同NaCl濃度的猝滅光譜圖類似.結(jié)果表明，隨著加入的表面活性劑量增加，BSA發(fā)射光譜的熒光強度減小，產(chǎn)生熒光猝滅.

2.3 Stern-Volmer猝滅常數(shù)及猝滅機制

對于低濃度區(qū)，表面活性劑對BSA熒光猝滅效應(yīng)基本符合Stern-Volmer方程［15］:

式中I0為未加入猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強度，I為猝滅劑濃度等于［D］時熒光物質(zhì)的熒光強度;Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù);τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命(生物大分子的τ0約為10-8s)，Ksv稱為 Stern-Volmer猝滅常數(shù).

圖2 THDAB濃度對BSA的熒光強度的影響

在THDAB濃度低于100μmol·L－1范圍內(nèi)，以最大發(fā)射波長345nm處BSA熒光強度按式(1)將I0/I對［NaCl］進行線性回歸，得到溫度為298K時THDAB-BSA體系的Stern-Volmer方程式猝滅常數(shù)Ksv和相應(yīng)線性相關(guān)系數(shù)R2，結(jié)果列于表1.

表1 THDAB-BSA 體系的猝滅常數(shù) Ksv及線性相關(guān)系數(shù) R2(T=298K，pH=7.1，［BSA］=4μmol·L－1)

由表1可知，在THDAB-BSA體系中，隨著NaCl濃度的增大，其Stern-Volmer猝滅常數(shù)Ksv增大;雙分子猝滅過程的速率常數(shù)Kq均大于生物分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)(2.0×1010L·mol－1·s－1)，這說明THDAB對BSA的熒光猝滅機制呈現(xiàn)靜態(tài)猝滅特征.

2.4 結(jié)合常數(shù)及離子強度對結(jié)合常數(shù)的影響

小分子對蛋白質(zhì)熒光的靜態(tài)猝滅可用位點模型來處理［16］:

式中I，I0分別是有和無猝滅劑時的熒光強度，KA是BSA與猝滅劑之間的結(jié)合常數(shù)，［D］是猝滅劑的平衡濃度，n是結(jié)合位點數(shù).由此方程以log［(I0－I)/I］對log［D］作圖，由直線斜率求得不同溫度下猝滅劑與BSA的結(jié)合位點數(shù)n，通過截距可以求出結(jié)合常數(shù)KA值.

將本實驗得到的猝滅光譜數(shù)據(jù)，按式(2)進行線性回歸，得到不同NaCl濃度下THDAD與BSA結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點數(shù)n及相關(guān)系數(shù)R2(見表2).

表2 THDAB與BSA結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點數(shù)n及相關(guān)系數(shù)R2(T=298K pH=7.1)

為了便于分析離子強度對THDAB與BSA結(jié)合作用的影響，將不同NaCl濃度下THDAB對BSA的熒光猝滅強度與［NaCl］作圖(見圖3)，同時將按上述模型擬合得到的KA與［NaCl］關(guān)系作圖(見圖4).

圖3 不同［NaCl］時THDAB-BSA的猝滅光譜

圖4 結(jié)合常數(shù)KA與NaCl濃度關(guān)系

結(jié)果表明，離子強度對THDAB與BSA結(jié)合作用有較大影響，主要表現(xiàn)在離子強度的增加導(dǎo)致:(1)THDAB對BSA的熒光猝滅強度減小(見圖3);(2)THDAB與BSA的結(jié)合作用減小、結(jié)合位點數(shù)下降(見圖4).產(chǎn)生這一結(jié)果的主要原因可歸結(jié)為以下兩個方面:隨著離子強度增加，鹽離子強烈地屏蔽蛋白質(zhì)分子和結(jié)合分子之間的靜電引力，使BSA分子難以在介質(zhì)表面上吸附和重排，表現(xiàn)為結(jié)合能力減弱［17］;NaCl的加入，造成較高的離子氛，降低了兩者的親和力［18］.本實驗的結(jié)果與文獻報道一致.

［1］劉瞻.表面活性劑的結(jié)構(gòu)特點與應(yīng)用［J］.懷化學(xué)院學(xué)報，2004，23(5):33-37.

［2］李偉娜，劉志紅，謝皓雪.表面活性劑的結(jié)構(gòu)特點及應(yīng)用研究進展［J］.長春醫(yī)學(xué)，2008，6(2):68-70.

［3］劉靜，徐桂英.表面活性劑與蛋白質(zhì)相互作用的研究進展［J］.日用化學(xué)工業(yè)，2003，33(1):29-32.

［4］吳丹，徐桂英.光譜法研究蛋白質(zhì)與表面活性劑的相互作用［J］.物理化學(xué)學(xué)報，2006，22(2):254-260.

［5］Gelamo E L，Tabak M.Spectroscopic studies on the interaction of bovine(BSA)and human(HSA)serum albumins with ionic surfactants［J］.Spectrochimica Acta Part A，2000，56:2255-2271.

［6］馮姣，王璟琳，楊斌盛.乙二胺-N，N’-二鄰氨基苯甲酸與牛血清白蛋白作用的熒光光譜研究［J］.光譜實驗室，2010，27(2):505-507.

［7］胡夢瑤，彭毛，吳輝，等.熒光法研究表面活性劑CTAB與蛋白質(zhì)的相互作用［J］.膠體與聚合物，2009，27(3):33-36.

［8］梁彥秋，孫鵬，鄧斌，等.十二烷基苯磺酸鈉與牛血清白蛋白的相互作用［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2009，32(1):23-26.

［9］李來生，黃偉東，王麗蘋，等.表面活性劑中DNA構(gòu)象變化的研究［J］.化學(xué)學(xué)報，2002，60(1):98-104.

［10］楊京芬，劉望才，朱家文，等.離子強度對牛血清白蛋白吸附特性的影響［J］.化學(xué)世界，2005(增刊):10-14.

［11］王華芳，李文友，何錫文，等.熒光法研究3-氨基苯硼酸與牛血清白蛋白間的相互作用［J］.化學(xué)學(xué)報，2007，65(1):43-48.

［12］邵爽，胡曉環(huán)，游金宗，等.N-烷基-N，N-二(2-羥乙基)-N-甲基溴化銨與牛血清白蛋白的相互作用［J］.物理化學(xué)學(xué)報，2010，26(11):2997-3001.

［13］盧倫，方成，胡澤斌，等.N-十六烷基-羥乙基-二甲基溴化銨與牛血清白蛋白的結(jié)合作用［J］.浙江外國語學(xué)院學(xué)報，2011(3):48-53.

［14］胡曉環(huán)，童威，邵爽，等.等溫滴定量熱法研究牛血清白蛋白與十二烷基二羥乙基甲基溴化銨的相互作用［J］.浙江大學(xué)學(xué)報:理學(xué)版，2011，38(5):525-529.

［15］許金鉤，王尊本.熒光分析法［M］.3 版.北京:科學(xué)出版社，2006.

［16］魏曉芳，劉會洲.Triton X-100與牛血清白蛋白的相互作用［J］.分析化學(xué)，2000，28(6):699-701.

［17］呂中，黃杰，陳嶸，等.pH及離子強度對抗癌藥物白藜蘆醇與人血清白蛋白相互作用的影響［J］.湖北大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2009，31(3):298-301.

［18］陶慧林，劉帥濤，黎舒懷，等.熒光法研究兩面針總生物堿與牛血清蛋白的相互作用［J］.化學(xué)世界，2012(9):536-542.