馮 民，魏云計*，朱臻怡，何 健，王小晉，柳 菡，丁 濤，吳 斌

(1.淮安出入境檢驗檢疫局，江蘇 淮安 223001;2.江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210001)

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素屬于氯霉素類抗生素，因?qū)Ω锾m氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有很強的活性，而表現(xiàn)出廣譜的抗菌能力，廣泛地應(yīng)用于動物養(yǎng)殖業(yè)。由于這些氯霉素類抗生素能導(dǎo)致人體產(chǎn)生再生障礙性貧血和溶血性貧血等毒副作用［1］，歐盟、美國等先后將其定為禁用藥物，不得用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，且動物源性食品中氯霉素的最高殘留限量為0.1～0.3 μg/kg，甲砜霉素和氟甲砜霉素的最高殘留限量一般為50～100 μg/kg。雖然它們在動物體內(nèi)殘留量低，但毒副作用依然存在。飼料一般是獸藥添加的主要載體，開展飼料中氯霉素類藥物檢測是從源頭進(jìn)行控制的有效方法，因此研究飼料中氯霉素類藥物檢測的方法具有重要意義。

目前國內(nèi)外關(guān)于氯霉素類藥物的殘留檢測方法已很成熟，主要采用酶聯(lián)免疫法［2－4］、高效液相色譜法［5－7］、氣相色譜 －質(zhì)譜法［8－10］和液相色譜 －串聯(lián)質(zhì)譜法［11－16］。由于飼料的組成成分復(fù)雜、基質(zhì)干擾較大，針對其氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留量同時檢測的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法國內(nèi)尚未見報道。本文利用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜的高選擇性和強抗干擾能力等特點，建立了飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留的快速定性定量方法，能滿足飼料進(jìn)出口檢測和國家藥物殘留監(jiān)控的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Finngan TSQ Quantum Ultra EMR串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI);C18柱(150 mm×2.1 mm i.d.，3.5 μm，Agilent公司)。

甲醇為色譜純;乙酸乙酯、正己烷、丙酮、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉均為分析純;氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度≥98%;氘代氯霉素(Chloramphenicol-D5)購自WITEGA Laboratorien Beelin－Adlershof GmbH，用甲醇溶解并配制成1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃避光保存;實驗用水均為去離子水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品提取 稱取(1.00±0.05)g飼料于50 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入50 μL 100 μg/L氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)溶液，加入4 mL 0.5 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液，于渦旋混合器上混勻30 s后靜置15 min待飼料浸潤，加入10 mL氨化乙酸乙酯(乙酸乙酯－25%氨水，98∶2)，于渦旋混合器上快速混勻30 s，超聲波提取10 min;以8 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上層有機溶液至50 mL梨形瓶中，于45℃水浴中減壓濃縮至干，加入4 mL 4%氯化鈉溶液使之充分溶解，待凈化。

1.2.2 凈 化 上述溶液用5 mL正己烷凈化脫脂，離心后棄去正己烷層;水層加入8 mL丙酮，離心后轉(zhuǎn)移上清液于50 mL具塞離心管中，加入10 mL二氯甲烷，渦旋30 s;以8 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移下層有機溶液至50 mL梨形瓶中，于45℃水浴中減壓濃縮至干，用1 mL甲醇－水(2∶8)溶解殘留物，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3 液質(zhì)聯(lián)用儀分析條件

色譜條件:色譜柱:Agilent ZORBAX SB－C18柱(150 mm×2.1 mm i.d.，3.5 μm);流動相:A為甲醇，B為水;流速:250 μL/min;進(jìn)樣量:25 μL;線性梯度洗脫程序:0～4.0 min，30%A;4.0～6.0 min，30%～90%A;6.0～6.5 min，90%～30%A;6.5～8.0 min，30%A;柱溫:30℃。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子掃描，噴霧電壓2 500 V，源內(nèi)誘導(dǎo)解離電壓10 V，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式檢測，其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素優(yōu)化的質(zhì)譜條件Table 1 The optimized MS－MS conditions for chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為降低高濃度氯霉素類藥物殘留對儀器的干擾，提高檢測靈敏度，采用流動相注射分析方法進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。流動相為甲醇－水(80∶20)，流速200 μL/min，蠕動泵注入1.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，流速為2 μL/min，通過“T”三通連接，六通閥控制流動相切入/切出質(zhì)譜檢測器;負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，找出準(zhǔn)確母離子峰，通過調(diào)節(jié)噴霧電壓和吹掃氣流優(yōu)化母離子的靈敏度和穩(wěn)定性，并對其子離子進(jìn)行全掃描，找出豐度較強的碎片離子，以母離子和子離子組成監(jiān)測離子對，以MRM模式對待測物進(jìn)行定性和定量分析。選擇豐度最強，并且色譜峰無干擾的碎片離子組成監(jiān)測離子對，m/z 321/152、m/z 354/185和m/z 356/336分別用于氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的定量分析，其它離子對則分別用于定性分析;內(nèi)標(biāo)氘代氯霉素定性離子對為m/z 326/157。

圖1 不同提取溶劑時氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的回收率Fig.1 Recoveries of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol using different extraction solvents

2.2 提取條件的優(yōu)化

氯霉素類藥物屬于弱極性物質(zhì)，易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑，可以通過這些溶劑進(jìn)行提取。乙酸乙酯對氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的提取效率最高，適合于動物組織樣品的提取，有文獻(xiàn)［17］報道堿化乙酸乙酯對蝦等水產(chǎn)品有更好的回收率。由于飼料含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素、礦物質(zhì)等復(fù)合組分，本研究比較了乙腈、丙酮、乙酸乙酯以及分別經(jīng)1%、2%、3%、4%氨水堿化乙酸乙酯的提取效率(見圖1)。實驗結(jié)果表明，當(dāng)采用2%氨水堿化乙酸乙酯進(jìn)行提取時，3種藥物的提取效率及穩(wěn)定性最好，隨著氨水比例的進(jìn)一步提高，其提取效率無明顯提高且對提取甲砜霉素的干擾增大，因此選用2%堿化乙酸乙酯為最佳提取溶劑。飼料樣品的水分很少，在提取前充分潤濕有利于目標(biāo)物的提取，本實驗采用磷酸鹽緩沖液潤濕飼料，可達(dá)到沉淀蛋白質(zhì)，減少氯霉素類藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合，提高回收率的效果。

2.3 樣品的凈化

堿化乙酸乙酯的提取效率雖高，但提取的非極性脂溶物較多，基質(zhì)干擾較大，需要進(jìn)一步凈化。文獻(xiàn)［17］以甲醇和4%氯化鈉溶液溶解目標(biāo)物，正己烷凈化脫脂兩次，乙酸乙酯進(jìn)行液－液分配萃取凈化，取乙酸乙酯層濃縮至干，用0.05%醋酸溶液溶解后再過C18固相萃取柱凈化。本研究結(jié)合液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜強選擇性和抗干擾能力的特點，用4 mL 4%氯化鈉溶液溶解目標(biāo)物，5 mL正己烷凈化脫脂，除去正己烷層，加入8 mL丙酮離心，除去變性蛋白質(zhì)后，再加入10 mL二氯甲烷進(jìn)行液－液分配萃取凈化。通過對比文獻(xiàn)［17］發(fā)現(xiàn)本方法可有效去除基質(zhì)干擾，省去固相萃取過程，縮短樣品前處理時間，空白樣品的加標(biāo)回收率為77%～108%，可滿足實驗要求。

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

配制6個不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶液中氯霉素、氟甲砜霉素的質(zhì)量濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L，甲砜霉素的質(zhì)量濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L，氘代氯霉素-D5的質(zhì)量濃度為5.0 μg/L，在優(yōu)化實驗條件下進(jìn)樣分析，測定其峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積比值(氯霉素峰或甲砜霉素或氟甲砜霉素的面積/氘代氯霉素-D5面積)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)如表2所示。在空白飼料基質(zhì)中添加混合標(biāo)準(zhǔn)品，以信噪比(S/N)≥3計算方法的檢出限(LOD);以信噪比(S/N)≥10計算方法的定量下限(LOQ)，3種化合物的檢出限和定量下限見表2。其相應(yīng)的MRM色譜圖見圖2A，標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖見圖2B。

表2 3種抗生素藥物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限和定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，limits of detection(LOD)and limits of quantitation(LOQ)of three antibiotic drugs

圖2 加標(biāo)飼料(A)及3種抗生素藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(B)的MRM色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring(MRM)chromatograms of spiked feed sample(A)and three antibiotic drugs standard solution(B)

2.5 回收率與精密度

選取陰性飼料樣品，添加3種氯霉素類標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)，氯霉素、氟甲砜霉素的加標(biāo)水平為0.3、1.0、5.0 μg/kg，甲砜霉素的加標(biāo)水平為 1.5、5.0、25.0 μg/kg，氘代氯霉素-D5的加標(biāo)水平為5.0 μg/kg，每個加標(biāo)水平做5次平行，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，待測物的加標(biāo)回收率為77%～108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.4%～10.9%。

表3 飼料樣品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol in feed sample(n=5)

2.6 實際樣品的檢測

應(yīng)用本方法對出口的寵物飼料及市場抽取的水產(chǎn)飼料和畜禽飼料共19個樣品進(jìn)行檢測，其中8個樣品中的氯霉素殘留量大于0.3 μg/kg，陽性率為42.1%;4個樣品中的氟甲砜霉素殘留量大于0.3 μg/kg，陽性率為21.1%;2個樣品中的甲砜霉素殘留量大于1.5 μg/kg，陽性率為10.5%，但上述樣品的藥物殘留量均小于國家殘留監(jiān)控的限量要求。

3 結(jié)論

本文建立了飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留同時測定的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該法采用串聯(lián)質(zhì)譜和同位素內(nèi)標(biāo)消除了飼料復(fù)雜基質(zhì)的影響，提高了定量的準(zhǔn)確性。該方法操作簡便，省去了固相萃取步驟，縮短了檢測周期，方法的靈敏度高，回收率好，可滿足實際檢測工作的需要。

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