包 鵬 唐彥君 劉 寧 (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030)

小腸作為機(jī)體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，同時具有黏膜免疫功能。由小腸的結(jié)構(gòu)特性決定了病原微生物在體內(nèi)停留時間長，作用面積大，因而極易引起腸道疾病，進(jìn)而影響機(jī)體健康。腸道相關(guān)淋巴組織，包括上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、固有層淋巴細(xì)胞、派氏集合淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)，在抵御腸道病原微生物過程中起重要作用，是腸道免疫的重要參與者[1]。這些腸道相關(guān)淋巴組織中的免疫細(xì)胞或直接作用于入侵病原微生物，或通過釋放各類細(xì)胞因子等方式對病原微生物發(fā)揮免疫作用[2]。腸道相關(guān)淋巴組織中的淋巴細(xì)胞主要由T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞組成。其中，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、固有層淋巴細(xì)胞及腸系膜淋巴結(jié)均含有較高比例的T淋巴細(xì)胞，而派氏集合淋巴結(jié)則是B淋巴細(xì)胞的含量較高[3，4]。其分泌產(chǎn)生的諸多細(xì)胞因子在維持腸道免疫平衡及對抗入侵病原中發(fā)揮的重要作用。其中的IFN-γ、TNF-α、IL-17 更是參與腸道細(xì)胞免疫和黏膜屏障的主要細(xì)胞因子。IFN-γ參與由腸組織損傷等引起的免疫調(diào)節(jié)并具有活化巨噬細(xì)胞等免疫能力;TNF-α則擁有直接改變上皮層完整性進(jìn)而改善腸損傷等生理功能;而IL-17是通過誘導(dǎo)炎癥趨化因子及抑菌蛋白的分泌的方式協(xié)助黏膜免疫屏障對抗胃腸道的病原微生物[5，6]。因此，上述部位淋巴細(xì)胞的數(shù)量及其分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17的水平與腸道免疫能力密切相關(guān)。近年來研究證實(shí)，乳酸菌及其所產(chǎn)生的胞外多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的生理功能[7]。其中廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中的干酪乳桿菌能夠通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量、調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子分泌等方式改善正?；蚣膊顟B(tài)下的腸道免疫能力[8，9]。但作為發(fā)酵食品中天然成分—由干酪乳桿菌分泌的重要免疫活性物質(zhì)胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)對腸道淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)尚未見報道，對不同腸相關(guān)淋巴組織淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)也未見報道。本研究采用WST-1法和ELISA法分別檢測經(jīng)干酪乳桿菌EPS處理后BALB/c小鼠小腸四部位腸相關(guān)淋巴組織中的淋巴細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞因子TNF-α、IL-17及 IFN-γ 分泌水平，旨在初步探討干酪乳桿菌胞外多糖對不同腸相關(guān)淋巴組織淋巴細(xì)胞的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及菌種 BALB/c小鼠，6周齡，雌性，由北京維通利華公司提供(批號:2012-021316)。無特殊病原的環(huán)境飼養(yǎng)(SPF級)，正常供食供水;干酪乳桿菌(購自于美國的ATCC，編號:ATCC393TM)。

1.1.2 試劑及試劑盒 本實(shí)驗(yàn)所用試劑及試劑盒包括:Percoll原液(Sigma公司)，膠原蛋白酶 IV(Sigma公司)，RPMI1640培養(yǎng)液，胎牛血清，小鼠TNF-α、IL-17 及 IFN-γ ELISA 檢測試劑盒(ebioscience公司)及WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 酶標(biāo)儀，電熱恒溫培養(yǎng)箱，CO2恒溫培養(yǎng)箱，無菌超凈工作臺，真空冷凍干燥機(jī)，高速冷凍離心機(jī)，倒置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 干酪乳桿菌胞外多糖的提取[10]將干酪乳桿菌按5%體積分?jǐn)?shù)接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)24小時，后對其依次進(jìn)行離心、三氯乙酸除蛋白、乙醇沉淀、透析和凍干處理，得到純化的干酪乳桿菌胞外多糖，即EPS。

1.2.2 腸相關(guān)淋巴細(xì)胞的制備[11，12]頸椎脫位法處死小鼠，取幽門至盲腸的全部小腸，浸泡于預(yù)冷的D-Hank's液中，仔細(xì)剝離腸系膜，小心剪下派氏集合淋巴結(jié)。用含有5%胎牛血清的D-Hank's液反復(fù)沖洗腸腔，將沖洗干凈的小腸延縱軸剪開，置于含有EDTA-DTT消化液的離心管中，37℃下180 r/min水平振蕩40分鐘，細(xì)胞懸液過400目不銹鋼濾網(wǎng)，離心收集，將細(xì)胞重懸于5 ml 40%Percoll液中，小心加在4 ml 70%Percoll液面上，1 000 r/min離心30分鐘，收集交界面處細(xì)胞，即為上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(Intraepithelial lymphocytes，IEL);將經(jīng) EDTA-DTT消化液消化后的小腸，置于含膠原蛋白酶消化液的離心管中，37℃下180 r/min水平振蕩30分鐘，細(xì)胞懸液過400目不銹鋼濾網(wǎng)，離心收集，將細(xì)胞重懸于5 ml 40%Percoll液中，小心加在4 ml 70%Percoll液面上，1 000 r/min離心30分鐘，收集交界面處細(xì)胞，分離得到固有層淋巴細(xì)胞(Lamina propria lymphocytes，LPL);將剝離的腸系膜及收集的派氏集合淋巴結(jié)進(jìn)行研磨，400目不銹鋼網(wǎng)過濾，離心收集，將細(xì)胞重懸于5 ml 40%Percoll液中，小心加在4 ml 70%Percoll液面上，1 000 r/min離心30分鐘，收集交界面處細(xì)胞，分別得到腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞(Mesenteric lymph nodes lymphocytes，MLNL)和派氏集合淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞(Peyer's Patches lymphocytes，PPL)。

1.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將無菌制備的IEL、LPL、PPL及MLNL調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106ml-1，以100 μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 μl不同濃度的干酪乳桿菌胞外多糖，使終濃度分別為 10、25、50、100 和200 μg/ml，另設(shè)等量 RPMI1640培養(yǎng)基為空白對照組。將96孔板置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，按照WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒步驟說明進(jìn)行操作，分別檢測 IEL、LPL、PPL及 MLNL增殖情況，并計算半數(shù)有效劑量(ED50)。

表1 不同濃度EPS對GALT淋巴細(xì)胞增殖能力的影響(A450，±s，n=5)Tab.1 Effect of different conentration EPS on GALT lymphocytes proliferation(A450，±s，n=5)

表1 不同濃度EPS對GALT淋巴細(xì)胞增殖能力的影響(A450，±s，n=5)Tab.1 Effect of different conentration EPS on GALT lymphocytes proliferation(A450，±s，n=5)

Note:Vs control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01.

EPS(μg/ml)IEL LPL PPL MLNL Control 0.225±0.013 0.250±0.011 0.215±0.00 20±0.011 7 0.242±0.010 10 0.237±0.007 0.254±0.012 0.216±0.003 0.253±0.008 25 0.275±0.018 0.274±0.007 0.228±0.005 0.268±0.007 50 0.283±0.019 0.284±0.007 0.252±0.007 0.297±0.019 100 0.295±0.021 0.292±0.013 0.272±0.009 0.314±0.015 200 0.290±0.024 0.284±0.009 0.262±0.008 0.3

1.2.4 細(xì)胞因子的檢測 將無菌制備的IEL、LPL、PPL及 MLNL調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×106ml-1，以100 μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 μl不同濃度的干酪乳桿菌胞外多糖，使終濃度分別為 10、25、50、100 和 200 μg/ml，另設(shè)等量 RPMI1640培養(yǎng)基為空白對照組。將96孔板置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，按照小鼠TNF-α、IL-17、IFN-γ檢測試劑盒步驟說明進(jìn)行操作，分別檢測IEL、LPL、PPL及MLNL上清液中細(xì)胞因子 TNF-α、IL-17、IFN-γ 分泌量，并計算 EPS 的半數(shù)有效劑量(EP50)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 每個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，每次設(shè)置五個平行。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(±s)表示，應(yīng)用SPSS 17軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，以O(shè)ne-way ANOVA方法分析各組數(shù)據(jù)之間的差異。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，以Probit回歸分析方法統(tǒng)計分析EPS的半數(shù)有效劑量(EP50)。

2 結(jié)果

2.1 EPS對小鼠小腸IEL、LPL、PPL及MLNL增殖的影響 EPS對BALB/c小鼠小腸IEL、LPL、PPL及MLNL增殖有一定的促進(jìn)作用，結(jié)果見表1。其對MLNL增殖能力的影響最強(qiáng)，在50～200 μg/ml濃度時與對照組相比均存在顯著差異(P＜0.05)，且呈劑量依賴性，ED50約為42.85 μg/ml;對于 IEL、LPL及PPL增殖能力在50～200 μg/ml濃度時的影響與對照組相比差異顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)，但并不呈劑量依賴性，而是在100 μg/ml濃度時達(dá)到最大值，ED50 分別約為24.75、28.76 和41.25 μg/ml。

2.2 EPS對小鼠IEL、LPL、PPL及MLNL分泌TNF-α調(diào)控 如圖1所示，EPS能夠明顯地抑制BALB/c小鼠小腸 IEL、LPL及 PPL分泌細(xì)胞因子 TNF-α。在50～200 μg/ml濃度時，IEL、LPL 上清液中 TNF-α的含量與對照組相比有極顯著性的降低(P＜0.01)，呈劑量依賴性，ED50約為 44.12和50.59 μg/ml;PPL上清液中的細(xì)胞因子TNF-α則在50 μg/ml后無法測出，ED50 約為 17.92 μg/ml。但是EPS對MLNL分泌TNF-α并無明顯的抑制作用，且在200 μg/ml時有顯著提高(P＜0.01)，ED50約為 123.56 μg/ml。

2.3 EPS對小鼠IEL、LPL、PPL及MLNL分泌IL-17調(diào)控 如圖2所示，EPS能夠明顯地促進(jìn)BALB/c小鼠小腸IEL、LPL、PPL及MLNL分泌細(xì)胞因子IL-17。IEL上清液中IL-17的含量在濃度25～200 μg/ml時與對照組相比有顯著性(P＜0.05)或極顯著性的升高(P＜0.01)，呈劑量依賴性，ED50約為29.16 μg/ml;LPL、PPL上清液中的細(xì)胞因子IL-17則在50 μg/ml時達(dá)到最大值，且差異極顯著(P＜0.01)，ED50約為33.12和27.15 μg/ml;MLNL上清液中的IL-17在200 μg/ml時達(dá)到最大值，且差異極顯著(P ＜0.01)，ED50 約為88.86 μg/ml。

圖1 ELISA法檢測EPS對GALT淋巴細(xì)胞分泌TNF-α的影響Fig.1 Effect of EPS on TNF-α induction of GALT lymphocytes by ELISA assay

圖2 ELISA法檢測EPS對GALT淋巴細(xì)胞分泌IL-17的影響Fig.2 Effect of EPS on IL-17 in duction of GALT lymphocytes by ELISA assay

圖3 ELISA法檢測EPS對GALT淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的影響Fig.3 Effect of EPS on IFN-γ induction of GALT lymphocytes by ELISA assay

2.4 EPS對小鼠IEL、LPL、PPL及MLNL分泌IFN-γ調(diào)控 如圖 3所示，EPS對 IEL、LPL、PPL及MLNL上清液中IFN-γ含量無明顯影響，與對照組之間的差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論

早在1988年，Gómez等[13]證明了青春雙歧桿菌所合成的EPS可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖。隨后，Kitazawa等[14]發(fā)現(xiàn)一種德式乳桿菌所分泌的EPS同樣具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的能力。與青春雙歧桿菌和德式乳桿菌一樣，干酪乳桿菌作為一種益生菌被廣泛應(yīng)用于乳制品生產(chǎn)等食品領(lǐng)域當(dāng)中。作為食源物質(zhì)，其產(chǎn)生的EPS對腸道相關(guān)淋巴組織中淋巴細(xì)胞免疫活性的調(diào)控，是干酪乳桿菌EPS對腸道黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵點(diǎn)之一。因?yàn)槟c相關(guān)淋巴組織中的淋巴細(xì)胞參與黏膜免疫系統(tǒng)對入侵抗原做出的一系列免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，而其較高的免疫活性則能夠保證黏膜免疫調(diào)節(jié)的快速和準(zhǔn)確。腸道淋巴細(xì)胞的免疫活性主要體現(xiàn)在增殖能力、分泌各類細(xì)胞因子能力和其細(xì)胞表面功能分子的表達(dá)等方面。本研究利用非常成熟并廣泛應(yīng)用的Percoll不連續(xù)密度梯度分離法嚴(yán)格操作分離BALB/c小鼠IEL、LPL、PPL及 MLNL細(xì)胞，并加以 EPS處理。WST-1增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干酪乳桿菌EPS可以顯著提高體外培養(yǎng)的IEL、LPL、PPL及MLNL的增殖能力。其中EPS對IEL、LPL和PPL增殖的影響趨勢相似。而MLNL的增殖則呈劑量依賴性，且增殖效果最為明顯。由此可見，干酪乳桿菌EPS能夠不同程度地促進(jìn)BALB/c小鼠四種主要腸相關(guān)淋巴組織中淋巴細(xì)胞的增殖，并可能通過此效應(yīng)初步增強(qiáng)腸道黏膜免疫中由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)或參與的免疫應(yīng)答。

已有報道證實(shí)，一些多糖類物質(zhì)具有調(diào)控腸道淋巴細(xì)胞和脾淋巴等分泌細(xì)胞因子的能力[15，16]。本研究在淋巴細(xì)胞分泌的諸多細(xì)胞因子中選擇了TNF-α、IL-17及 IFN-γ 作為研究對象，以檢測干酪乳桿菌EPS對腸相關(guān)淋巴細(xì)胞分泌典型細(xì)胞因子的調(diào)控。IFN-γ主要由活化的Th1型 CD4+T淋巴細(xì)胞分泌，γδT淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等也可分泌;TNF-α則主要由巨噬細(xì)胞分泌，Th1型CD4+T淋巴細(xì)胞、γδT淋巴細(xì)胞等也是其分泌細(xì)胞;IL-17的主要分泌細(xì)胞為Th17細(xì)胞、γδT淋巴細(xì)胞等。本研究結(jié)果表明，干酪乳桿菌EPS可以抑制體外培養(yǎng)的IEL、LPL和 PPL分泌 TNF-α，原因可能是干酪乳桿菌EPS直接抑制主要分泌細(xì)胞TNF-α或者促進(jìn)了相關(guān)抑制因子的分泌間接地抑制TNF-α水平。但干酪乳桿菌EPS對MLNL中TNF-α的分泌無明顯抑制作用，相反TNF-α的分泌量在高濃度時有顯著提高，這樣的結(jié)果可能與MLNL含有不同類型、不同含量的淋巴細(xì)胞亞群有關(guān)。MLNL中CD4+T淋巴細(xì)胞的含量較高，IEL、LPL和PPL中CD4+T淋巴細(xì)胞含量較低，而 Th1型 CD4+T淋巴細(xì)胞具有分泌TNF-α的能力。因此MLNL中TNF-α水平的增加可能揭示了EPS具有調(diào)控Th1型CD4+T淋巴細(xì)胞分泌TNF-α的能力，但具體分子學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步確定。與調(diào)控TNF-α不同，干酪乳桿菌EPS對四種腸相關(guān)淋巴細(xì)胞IL-17的分泌呈現(xiàn)促進(jìn)作用，其中IEL及MLNL最為顯著，且呈劑量依賴。在四種淋巴組織中均含有一定的IL-17分泌細(xì)胞，如Th17細(xì)胞、γδT淋巴細(xì)胞等，因此推斷干酪乳桿菌EPS可能具有調(diào)控IL-17主要分泌細(xì)胞的能力。

研究結(jié)果初步表明，干酪乳桿菌EPS可體外促進(jìn)腸相關(guān)組織中淋巴細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-17的分泌，初步推斷干酪乳桿菌EPS具有調(diào)節(jié)腸相關(guān)淋巴組織淋巴細(xì)胞免疫活性的能力，能夠改善腸黏膜免疫系統(tǒng)。但EPS通過口服途徑到達(dá)腸道，以大分子形式接觸腸相關(guān)淋巴細(xì)胞后，是否仍具有與體外實(shí)驗(yàn)相符的功能仍需進(jìn)一步證實(shí)。

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