鄭樹

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的過程是以患者為中心、以臨床問題為導(dǎo)向、以成果應(yīng)用為目標(biāo)而進(jìn)行的基礎(chǔ)研究，是多層次、多學(xué)科交叉融合的系統(tǒng)研究工程［1］。近十余年來，結(jié)直腸癌基礎(chǔ)研究及臨床診治方面有了很大進(jìn)展，但其總生存率仍有待提高。轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是腫瘤治療失敗最主要原因，并直接影響預(yù)后。結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)決定于腫瘤本身的生物學(xué)特征，包括病理類型和分期等。然而，同一形態(tài)、類型或分期的患者經(jīng)同一治療方案治療后往往效果迥異，預(yù)后不一。如能夠結(jié)合分子水平的分類、分型或分期將更精準(zhǔn)的體現(xiàn)其客觀生物學(xué)特征。如何對結(jié)直腸癌進(jìn)行精準(zhǔn)的分子分型是當(dāng)前結(jié)直腸癌在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所面臨的重要問題，也是判斷或預(yù)測轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)分子事件研究的重要方面。研究結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)分子事件包括上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)及間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial transition，MET)的系統(tǒng)研究。以結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測為目標(biāo)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究基本過程歸納如下:

一、發(fā)掘(discovery)

首先是發(fā)現(xiàn)或發(fā)掘相關(guān)標(biāo)志物?？筛鶕?jù)不同臨床病理表型的組織樣本，如有肝轉(zhuǎn)移及無肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌原發(fā)灶，對比二者基因表達(dá)譜中存在明顯差異的基因。此類研究如，經(jīng)基因表達(dá)譜芯片篩選［1］在有轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的骨橋蛋白(osteopontin)及顯著低表達(dá)的Spacr L1，這兩個(gè)基因在表達(dá)量上顯然與轉(zhuǎn)移浸潤相關(guān)，可能為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，這兩個(gè)基因必然與預(yù)后相關(guān)。

二、鑒定(identification)

第二步需證明發(fā)現(xiàn)的基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞中存在、表達(dá)程度和相關(guān)功能，包括高不同表達(dá)水平對EMT-MET相關(guān)變化的影響，包括細(xì)胞增殖、生長曲線、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及與轉(zhuǎn)移相關(guān)的遷移、浸潤等。明確基因的功能，同時(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭需b定研究該基因表達(dá)對小鼠移植瘤轉(zhuǎn)移的影響。

三、證實(shí)(verification)

發(fā)現(xiàn)及鑒定的基因在臨床是否可預(yù)測腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后，或是否可作為干預(yù)阻斷的候選靶點(diǎn)，這些需要進(jìn)一步證實(shí)。為此，要應(yīng)用一定數(shù)量的人體樣本或病理組織臘塊標(biāo)本，并結(jié)合臨床病理信息，包括治療后的隨訪資料。分析該基因與生存率和復(fù)發(fā)率的相關(guān)性，進(jìn)而證實(shí)其對臨床預(yù)測的意義。

四、確認(rèn)(validation)

該基因作為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)標(biāo)志物的臨床應(yīng)用可行性、實(shí)用價(jià)值與實(shí)際意義需要進(jìn)一步確認(rèn)。為此，應(yīng)開展多中心大樣本試驗(yàn)。以同一方法檢測分析，以驗(yàn)證及確認(rèn)該標(biāo)志物的意義，進(jìn)而可推廣應(yīng)用。

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究源于臨床需求，亦回饋服務(wù)于臨床，是基礎(chǔ)與臨床緊密結(jié)合的系統(tǒng)工程。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究不僅需具備基礎(chǔ)研究的可靠技術(shù)手段和實(shí)驗(yàn)設(shè)備，以準(zhǔn)確提供精確反映腫瘤生物特征與功能的分子表型的結(jié)果，同時(shí)要求規(guī)范的臨床病理診斷，不可或缺的生物組織樣本庫，規(guī)范的長期患者隨訪資料，以及高質(zhì)量研究機(jī)構(gòu)間的多中心合作，這樣結(jié)論才會具有臨床指導(dǎo)價(jià)值。

現(xiàn)列舉以下已發(fā)表的幾組資料供同道們參考:

1．SPARCL1基因:該基因是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種糖蛋白，與細(xì)胞粘附增殖有關(guān)。在很多正常組織中有較高表達(dá)。Hu等［2］從有、無肝轉(zhuǎn)移的兩組結(jié)直腸癌原發(fā)灶基因表達(dá)譜中篩選出有明顯差異的基因，發(fā)現(xiàn)SPARCL1基因在無肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌原發(fā)灶中明顯高表達(dá)，而在有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中明顯表達(dá)低。作者經(jīng)qRT-PCR和人體樣本免疫組化鑒定均確定無轉(zhuǎn)移原發(fā)灶表達(dá)明顯高于有轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌(P＜0．05)，在腫瘤分化差結(jié)直腸癌蛋白表達(dá)低或無，在腫瘤分化好的結(jié)直腸癌蛋白表達(dá)明顯較高。經(jīng)功能研究，明確了SPARCL1抑制腸癌RKO細(xì)胞的侵襲、移動(dòng)及穿透能力，小鼠體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)該基因抑制體內(nèi)成瘤及肝轉(zhuǎn)移(P＜0．009)。從基因表達(dá)水平(qRT-PCR)及蛋白水平(western blot)均發(fā)現(xiàn)與EMT相關(guān)。SPARCL1表達(dá)增高與E-cadherin表達(dá)增高、Vimentin及N-cadherin表達(dá)降低明顯相關(guān)。RKO及SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染高表達(dá)SPARCL1或加入該蛋白，均可見細(xì)胞有EMT和MET腺管樣形態(tài)(圖1)。SPARCL1基因功能鑒定后，虞舒靜等［3］分析了1999年至2004年隨訪36個(gè)月的156例大腸癌組織標(biāo)本，以免疫組織化學(xué)法檢測SPARCL1表達(dá)水平。將從低到高表達(dá)水平依次設(shè)為0～3，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SPARCL1的結(jié)直腸癌患者的生存率明顯高于低表達(dá)患者(P=0．043)(圖2)，從臨床單中心病例證實(shí)了該基因可做為預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的標(biāo)志物，但仍需進(jìn)一步確認(rèn)。2011年，中美兩大癌癥研究中心對SPARCL1基因進(jìn)行了雙中心大樣本對比分析。兩組對比分別從各自生物樣本庫(浙江大學(xué)腫瘤研究所412例，美國希望城醫(yī)學(xué)中心222例)取結(jié)直腸癌樣本進(jìn)行確認(rèn)。分析結(jié)果確認(rèn)SPARCL1基因表達(dá)高者預(yù)后較好(圖3)。

圖1 SW620及RKO細(xì)胞轉(zhuǎn)入SPARCL1或培養(yǎng)液中加入該蛋白的光鏡下觀察圖像，顯示細(xì)胞排列呈腺管樣形態(tài)(MET ×10)

圖2 免疫組織化學(xué)檢測SPARCL1蛋白表達(dá)強(qiáng)度分層分析，顯示SPARCL1蛋白高表達(dá)者生存率明顯高于低表達(dá)者。

2．SOX2基因:該基因是一個(gè)重要的干細(xì)胞標(biāo)志物，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展極為相關(guān)，但與腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤以及在EMT-MET轉(zhuǎn)化中的作用尚無人報(bào)道。Han等［4］進(jìn)行了體內(nèi)外研究，敲除結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞的SOX2基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SW620細(xì)胞由EMT轉(zhuǎn)向MET，細(xì)胞轉(zhuǎn)移浸潤功能明顯減弱。作者為證實(shí)SOX2基因表達(dá)在結(jié)直腸癌中的意義，對44例結(jié)直腸癌組織石臘標(biāo)本進(jìn)行免疫組化(IHC)檢測，以觀察SOX2蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)44例結(jié)直腸癌中陽性表達(dá)者有9例，其中7例有肝轉(zhuǎn)移(77．8%)，8例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(88．8%)。而 SOX2陰性者分別為40．0%(14/35，P=0．029)及 51．4%(18/35，P=0．039)。從分期看，T1～2期腫瘤患者，SOX2表達(dá)均為陰性。9例SOX2表達(dá)陽性者均為T3～4(P=0．0006)。說明從對臨床樣本的研究中也體現(xiàn)SOX2與轉(zhuǎn)移浸潤相關(guān)。從預(yù)測預(yù)后的分子標(biāo)志物角度看，SOX2基因研究尚缺乏足夠的具有完整隨訪生存率病例的證實(shí)與確認(rèn)，但該發(fā)現(xiàn)說明了SOX2與轉(zhuǎn)移浸潤相關(guān)并具有促EMT的作用，這為做進(jìn)一步證實(shí)與確認(rèn)提供了基礎(chǔ)。

圖3 兩組生物樣本庫SPARCL1表達(dá)與相關(guān)因素分析情況

MGA2基因 該基因?yàn)楹塑账徇€原酶小亞基M2，其過度表達(dá)會促進(jìn)腫瘤增殖及浸潤。經(jīng)美國希望城醫(yī)學(xué)中心217例腸癌患者及浙江大學(xué)腫瘤研究所220例腸癌患者驗(yàn)證［5］，證實(shí)高表達(dá)者在兩大組中總生存期和無病生存期均明顯降低，其相對危險(xiǎn)度在希望城組和浙江大學(xué)組分別為1．88和2．06。多因素分析提示錯(cuò)配修復(fù)基因缺失者風(fēng)險(xiǎn)度明顯增加，如在希望城組達(dá)12．2。顯然，HMGA2基因是預(yù)測預(yù)后的獨(dú)立因素。

總之，結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究最終是為臨床服務(wù)，目標(biāo)在于解決臨床需要。規(guī)范樣本的取用和檢測，開展多中心協(xié)作，在大數(shù)量的標(biāo)本中確認(rèn)與臨床的關(guān)系，這些是必須的。我國人口眾多，人群生物組織樣本資源較為豐富，但需注意收集與保存。臨床標(biāo)本的合理利用應(yīng)引起足夠的關(guān)注與重視。

［1］ 鄭樹，黃彥欽，董琦，等．結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究．中華胃腸外科雜志，2013，16(1):4-7．

［2］ Hu H，Zhang H，Ge W，et al．Secreted protein acidic and rich in cysteines-like 1 suppresses aggressiveness and predicts better survival in colorectal cancers．Clin Cancer Res，2012，18(19):5438-5448．

［3］ Yu SJ，Yu JK，Ge WT，et al．SPARCL1，Shp2，MSH2，E-cadherin，p53，ADCY-2 and MAPK are prognosis-related in colorectal cancer．World J Gastroentero，2011，17(15):2028-2036．

［4］ Han X，F(xiàn)ang X，Lou X，et al．Silencing SOX2 induced mesenchymal-epithelial transition and its expression predicts liver and lymph node metastasis of CRC patients．PLoS One，2012，7(8):e41335．

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鄭樹．結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究［J/CD］．中華結(jié)直腸疾病電子雜志，2013，2(1):2-5．