成文召，麻艷芳，邵鄰相，趙鐵軍，張均平，徐玲玲，呂學(xué)維

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

佛手(fingered citron)為蕓香科(Rutaceae)柑桔屬灌木香櫞(Citrus medica L.)的變種.佛手是我國傳統(tǒng)的名貴藥材，其葉、花、果實均可入藥，具有化痰止咳、舒肝和胃、理氣止吐等功效［1］.佛手中揮發(fā)油含量較高，主要成分是烯烴類化合物［2-3］.現(xiàn)代研究表明佛手果實中揮發(fā)油具有延緩衰老［4］、增強機體免疫力［5］、抗癌［6-7］、抑菌［8-9］和鎮(zhèn)靜［10］等作用.已有的研究報道側(cè)重于佛手果實中的揮發(fā)油成分和生物活性，但有關(guān)佛手葉揮發(fā)油對癌細胞影響的研究尚無報道.本文著重探討了佛手葉揮發(fā)油對HeLa 癌細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響，為佛手資源的綜合利用和開發(fā)提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 佛手葉揮發(fā)油制備

新鮮佛手葉洗凈勻漿，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，無水硫酸鈉干燥，4 ℃保存.精確稱取佛手葉揮發(fā)油100 mg，加入10 μL 吐溫-80，渦旋震蕩混勻，磷酸鹽緩沖液稀釋至1 mL，過濾滅菌，用DMEM 純培養(yǎng)基稀釋至所需濃度.

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);噻唑藍(MTT)，吐溫-80，二甲基亞砜(DMSO)，Hoechst 33342，碘化丙啶(PI)，戊二醛，Triton X-100，牛血清白蛋白(BSA)，Anti-α-Tubulin 鼠多克隆抗體(Sigma 公司);Alexa Fluor?488 驢抗鼠IgG，防熒光淬滅劑(Invitrogen 公司).3111 型CO2細胞培養(yǎng)箱，1500 型全自動酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo 公司);Eclipse E600 型熒光顯微鏡(日本Nikon 公司);KYKY-1000B 型掃描電子顯微鏡(中國科學(xué)院科學(xué)儀器廠);H-600 透射電子顯微鏡(日本日立公司);TCS SP5 激光共聚焦掃描顯微鏡(德國Leica 公司).

1.3 細胞培養(yǎng)與藥物處理

HeLa 細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所，接種于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基(含100 μg/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素)中，在37 ℃，5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗.細胞以1 ×104/孔接種于96 孔板中，以5 ×105/孔接種于含潔凈蓋玻片的6 孔板中，培養(yǎng)12 h 后，各組加入相應(yīng)量的藥物使其終質(zhì)量濃度為200，400 和800 μg/mL，同時設(shè)0.01%吐溫-80 對照組，24 h 后檢測.

1.4 噻唑藍法檢測細胞活力

佛手葉揮發(fā)油作用于細胞6，12 和24 h 后，每孔加入1 mg/mL 噻唑藍溶液20 μL，孵育4 h后，棄培養(yǎng)基，加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩15 min，酶標(biāo)儀570 nm 波長下測定A 值，按下式計算抑制率:

1.5 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

佛手葉揮發(fā)油處理HeLa 癌細胞24 h 后，倒置顯微鏡觀察，拍照.

1.6 熒光染色觀察細胞核形態(tài)

取細胞爬片，滴加Hoechst 33342 染液(5 μg/mL)和PI 染液(5 μg/mL)，避光孵育30 min，熒光顯微鏡觀察，拍照.

1.7 掃描電鏡觀察細胞表面結(jié)構(gòu)

實驗方法參照文獻［7］.

1.8 透射電鏡觀察細胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)

細胞以2.5%戊二醛溶液、2%瓊脂溶液、1%鋨酸溶液依次固定，乙醇梯度脫水，包埋，切片，透射電鏡觀察，拍照.

1.9 免疫熒光檢測微管纖維結(jié)構(gòu)與分布

取細胞爬片，磷酸鹽緩沖液清洗3 ×2 min;3.7%甲醛溶液4 ℃固定過夜;磷酸鹽緩沖液清洗3 ×5 min;0.2% Triton X-100 溶液透膜5 min;磷酸鹽緩沖液清洗3 ×5 min;5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉30 min;α-Tubulin 鼠多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜;磷酸鹽緩沖液清洗3 ×8 min;Alexa Fluor?488 驢抗鼠IgG(1∶1 000)室溫避光孵育30 min;磷酸鹽緩沖液清洗3 ×8 min;雙蒸水漂洗2 次;加入防熒光淬滅液，4 ℃晾干，指甲油封片，激光共聚焦顯微鏡檢測，拍照.

1.10 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析.P ＜0.05為差異有顯著性意義，P ＜0.01 為差異有極顯著性意義.

2 結(jié)果

2.1 佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞活力的影響

如圖1 所示:0.01%吐溫對照組抑制率不明顯;31.25 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油處理HeLa 癌細胞6，12 和24 h 后，抑制率分別為7.41%，9.12%和6.10%，抑制率變化不明顯;62.5 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油處理HeLa 癌細胞24 h 后，抑制率為10.61%，與對照組相比差異極顯著(P ＜0.01);125，250 和500 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油處理HeLa癌細胞6，12 和24 h 后，抑制率隨著揮發(fā)油質(zhì)量濃度增加和處理時間延長而增大.表明低劑量佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞無明顯的抑制作用，而中、高劑量的佛手葉揮發(fā)油能夠抑制HeLa 細胞的增殖，且呈劑量和時間依賴性.

圖1 佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞增殖的影響

2.2 佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞形態(tài)的影響

由圖2 可見:對照組與陰性對照組(A，B)細胞分布均勻，細胞大而飽滿，形態(tài)規(guī)則，伸展性好，貼壁牢固;陽性對照組(C)細胞體積縮小，呈懸浮狀態(tài)，形態(tài)不規(guī)則，有凋亡小體產(chǎn)生;200 μg/mL佛手葉揮發(fā)油組(D)細胞貼壁性差，細胞皺縮聚集成團，有凋亡小體出現(xiàn);400 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(E)細胞體積縮小，多數(shù)呈懸浮狀態(tài)，細胞碎片增多;800 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(F)細胞扁平溶脹，立體感下降，內(nèi)容物外泄，出現(xiàn)大量細胞碎片，表明細胞結(jié)構(gòu)被破壞.

圖2 佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞形態(tài)的影響(Bar=50 μm×200)

2.3 佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞核的影響

由圖3 可見:對照組與陰性對照組(A，B)染色呈均一的弱藍色熒光，細胞核形態(tài)規(guī)則，多呈橢圓形;陽性對照組(C)細胞核成團堆積，細胞核固縮，染色質(zhì)凝集分布在核邊緣，染色呈亮藍色團塊;200 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(D)細胞核體積縮小，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)凝集邊緣化，與陽性對照類似;400 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(E)細胞核輪廓模糊，少數(shù)染色質(zhì)邊集化，大多數(shù)染色質(zhì)裂解呈碎片;800 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(F)出現(xiàn)大量細胞核碎片，表明細胞核結(jié)構(gòu)被破壞.

圖3 佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞核形態(tài)的影響(Bar=20 μm×250)

2.4 佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞表面超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖4 可見:對照組和陰性對照組(A，B)細胞形態(tài)規(guī)則，伸展性好，貼壁牢固，細胞表面微絨毛豐富;陽性對照組(C)細胞皺縮，呈圓形，細胞表面微絨毛消失，出現(xiàn)泡狀突起;200 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(D)細胞形狀不規(guī)則，貼壁性差，表面微絨毛消失，出現(xiàn)膜泡;400 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(E)細胞皺縮，細胞膜崩解，開始從細胞表面往下脫落;800 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(F)細胞明顯皺縮，表面出現(xiàn)大量的孔洞，表明細胞表面結(jié)構(gòu)已被破壞.

圖4 佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞表面超微結(jié)構(gòu)的影響

2.5 佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的影響

從圖5 可見:對照組和陰性對照組(A，B)細胞膜完整，表面微絨毛豐富，細胞器分布均勻，核膜完整，染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯;陽性對照組(C)細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞膜被破壞，核物質(zhì)致密呈斑塊狀，出現(xiàn)凋亡小體;200 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(D)細胞表面微絨毛消失，細胞膜被破壞，染色質(zhì)凝集，有凋亡小體出現(xiàn);400 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(E)細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，內(nèi)容物與細胞器外泄，染色體斷裂，呈無規(guī)律細沙狀;800 μg/mL佛手葉揮發(fā)油組(F)細胞溶脹，內(nèi)容物大量外泄，細胞空泡化，表明細胞已經(jīng)壞死.

圖5 佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的影響(Bar=1 μm)

2.6 佛手葉揮發(fā)油對HeLa細胞微管分布的影響

佛手葉揮發(fā)油作用于HeLa 癌細胞24 h 后，用免疫熒光結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察細胞的整體形態(tài)與微管分布，結(jié)果如圖6 所示:對照組和陰性對照組(A，B)微管連貫性強，呈清晰絲狀結(jié)構(gòu)，圍繞在細胞核周圍，均勻分布于整個細胞中;陽性對照組(C)細胞體積縮小，細胞表面出現(xiàn)泡狀突起，微管被破壞;200 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(D)細胞呈圓形，微管遭到一定程度的破壞，呈模糊狀，與陽性對照類似;400 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(E)細胞呈球形，微管遭到破壞，內(nèi)容物開始外泄;800 μg/mL 佛手葉揮發(fā)油組(F)細胞溶脹裂解，形態(tài)不規(guī)則，微管破壞后大量外泄.

圖6 佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞微管纖維結(jié)構(gòu)與分布的影響(Bar=5 μm)

3 討論

細胞死亡的主要方式包括細胞凋亡和壞死.目前細胞凋亡與壞死的檢測方法有很多種，但形態(tài)觀察仍然是檢測細胞凋亡與壞死的可靠手段.細胞凋亡時主要表現(xiàn)為:細胞萎縮，細胞膜結(jié)構(gòu)完整，細胞核染色質(zhì)邊集化，出現(xiàn)凋亡小體等特征.細胞壞死時表現(xiàn)為:細胞溶脹，細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)細胞碎片，細胞器和內(nèi)含物大量外泄，細胞空泡化.

本實驗采用不同劑量的佛手葉揮發(fā)油分別處理HeLa 癌細胞6，12 和24 h 后，噻唑藍法檢測細胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)佛手葉揮發(fā)油對HeLa 細胞具有明顯的抑制作用，且呈劑量和時間依賴性.低劑量(200 μg/mL)佛手葉揮發(fā)油處理HeLa 細胞24 h 后，倒置顯微鏡觀察到細胞呈懸浮狀態(tài)，成團聚集;Hoechst 33342/PI 染色結(jié)果顯示細胞核固縮，染色質(zhì)凝集邊緣化，呈亮藍色熒光塊狀顆粒;而中、高劑量(400，800 μg/mL)佛手葉揮發(fā)油處理后，細胞呈懸浮狀態(tài)，出現(xiàn)大量的細胞碎片，細胞核破碎.此結(jié)果與呂學(xué)維等［11］的研究結(jié)果一致.掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn):佛手葉揮發(fā)油低劑量組細胞表面微絨毛消失，出現(xiàn)膜泡;而高劑量組細胞萎縮，細胞膜崩解，與麻艷芳等［7］描述的結(jié)果相對應(yīng).透射電鏡觀察結(jié)果顯示:佛手葉揮發(fā)油低劑量組細胞核形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)凝集邊緣化，出現(xiàn)凋亡小體等特征，與文獻［12-13］中報道的細胞凋亡特征類似;而中、高劑量組細胞染色質(zhì)斷裂呈細沙狀，內(nèi)容物大量外泄，細胞空泡化，可能是佛手葉揮發(fā)油作為脂溶性物質(zhì)破壞了細胞的膜結(jié)構(gòu)造成的.此外，免疫熒光檢測結(jié)果顯示，佛手葉揮發(fā)油處理HeLa 癌細胞24 h 后，微管受到不同程度的破壞，隨著藥物劑量的增大，微管纖維破壞程度更加嚴(yán)重，結(jié)果與曹波等［14］的研究結(jié)果類似.

綜上所述，佛手葉揮發(fā)油能夠抑制HeLa 癌細胞的增殖，低劑量佛手葉揮發(fā)油能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，而中、高劑量的佛手葉揮發(fā)油能夠?qū)е录毎麎乃?

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