鄭祖艷，徐博佳，周麗穎，吳明娟

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)研究院，黑龍江哈爾濱150001)

抑郁癥目前已成為全球性的主要精神衛(wèi)生問題，世界衛(wèi)生組織預計，到2020年抑郁癥造成的疾病負擔將列為全球疾病總負擔第2位，僅次于冠心病，因而被稱為新世紀健康的第二殺手[1]，其病因尚未完全闡明，但生活事件(life events，LEs)，尤其是應激性生活事件起“扳機”作用[2]。抑郁癥發(fā)病前約92%的患者有LEs，提示LEs在抑郁癥發(fā)生中起重要作用[3]。在神經內分泌改變上體現(xiàn)為下丘腦－垂體－腎上腺(hypothalamus pituitary ad －renal，HPA)軸的功能亢進，在應激引起的一系列病理生理和行為反應中，促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)起著重要作用，因此筆者選擇目前國外學者廣泛采用的慢性輕度不可預見性應激刺激結合孤養(yǎng)法相結合建立抑郁動物模型展開研究[4－5]，觀察針刺對下丘腦 CRF 表達的影響，深入探討針刺治療抑郁癥的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

64只3月齡清潔級健康Wister雄性大鼠，體重180～220 g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心。

1.2 實驗分組

將動物在實驗室適應性飼養(yǎng)1周，自由進食水。然后對每只大鼠進行開野實驗，剔除水平運動加垂直運動次數(shù)平均大于100次或少于50次的大鼠，再將64只大鼠隨機分為正常對照組、模型組、鹽酸氟西汀組和頭穴叢刺組各16只，正常對照組4只/籠，其余組單籠飼養(yǎng)，末次治療后再將正常對照組、模型組、鹽酸氟西汀組和頭穴叢刺組各隨機再分為兩組，每組8只大鼠，分別進行大鼠下丘腦CRF陽性細胞表達試驗及下丘腦CRFmRNA相對含量表達試驗。

1.3 實驗器材

－70℃冰箱;恒溫高速離心機;促腎上腺皮質激素釋放因子放免試劑盒;自制敞箱(長80 cm、寬80 cm、高40 cm);華佗針灸針;電針治療儀。

1.4 模型制備

按照文獻方法[6]制備大鼠慢性應激抑郁模型。模型組、頭穴叢刺組、鹽酸氟西汀組單籠飼養(yǎng)并接受14天各種不同的應激刺激，使動物不能預料刺激的發(fā)生。刺激包括冰水游泳、熱應激、禁水、禁食、夾尾、電擊足底、搖晃、晝夜顛倒等刺激，每天隨機安排1種，在刺激之前給予持續(xù)10 s的鈴聲提示，正常對照組每日抓取1次，予以10 s鈴聲提示但不予刺激。

1.5 治療方法

經14天慢性應激刺激后，鹽酸氟西汀組給予鹽酸氟西汀1 mg/kg每日1次，連續(xù)給藥14天;頭穴叢刺組參照《實驗動物穴位圖譜》選“百會”、“神庭”及“四神聰”，用華佗牌30號半寸毫針進行針刺，向后平刺0.2 cm左右，“百會”、“神庭”針柄接電針治療儀，頻率2 Hz，電流強度0.6 mA左右，以大鼠頭部微顫為宜。留針20 min，每日1次，連續(xù)針刺14天。

1.6 取材及標本制備

對各組大鼠進行開野實驗后:①隨機每組取8只，將大鼠麻醉后，仰臥固定于手術臺，開胸暴露心臟，左心室插管高壓灌注生理鹽水，同時剪開右心耳，待肝臟變白后再用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，浸于4%多聚甲醛固定24 h，分離下丘腦，將下丘腦石蠟包埋、切片，免疫組化法檢測各組大鼠下丘腦CRF陽性細胞的表達。②每組取另外8只，將大鼠麻醉后立即斷頭取腦，迅速分離下丘腦置勻漿器，冰浴加Trizol充分混勻后加入氯仿低溫高速離心取上清液，加入異丙醇，再次低溫高速離心，棄上清液，留取白色沉淀，經乙醇洗滌烘干，加DEPC水溶解、55℃促溶10 min后，置－70℃冰箱內貯存?zhèn)溆茫琑T－PCR法檢測下丘腦CRFmRNA表達。

1.7 統(tǒng)計方法

運用統(tǒng)計軟件SPSS16分析實驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 開野實驗結果

見表1。造模前各組大鼠的水平及垂直運動次數(shù)無顯著差異(P＞0.05)。治療前與正常組相比，模型組、頭穴叢刺組、鹽酸氟西汀組大鼠的水平及垂直運動次數(shù)明顯降低，有顯著性差異(P＜0.05);治療后，頭穴叢刺組、鹽酸氟西汀組的水平及垂直運動次數(shù)與模型組相比明顯增加，有顯著性差異(P＜0.05)。通過觀察模型組大鼠水平及垂直運動次數(shù)逐漸減少說明隨刺激的時間延長，大鼠的抑郁程度也在逐步加重，提示頭穴叢刺療法能增加抑郁模型大鼠的運動度及好奇度，具有防治抑郁的作用。

表1 Open－filed法測定各組大鼠水平及垂直運動情況(±s，次)

表1 Open－filed法測定各組大鼠水平及垂直運動情況(±s，次)

注:與正常組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，▲P ＜0.05;與頭穴叢刺組比較，△P＞0.05。

16 81.1 ±15.7 77.3 ±14.7 72.1 ±15.9模型組 16 79.3 ±16.3 42.3 ±12.8* 29.9 ±11.2頭穴叢刺組 16 79.6 ±15.9 44.6 ±14.5* 61.4 ±19.9▲鹽酸氟西汀組 16 82.7 ±14.8 41.0 ±15.6* 68.2 ±14.3造模前 治療前 治療后正常組組別 n▲△

2.2 下丘腦CRF的表達

見表2。模型組與正常組比較，大鼠下丘腦CRF陽性細胞比及下丘腦CRFmRNA相對含量表達模型組明顯高于正常組(P＜0.05)，頭穴叢刺治療可明顯降低抑郁模型大鼠下丘腦內的CRF表達(P＜0.05)，療效與鹽酸氟西汀組類似(P＞0.05)。

表2 各組大鼠下丘腦CRF陽性細胞比及下丘腦CRFmRNA相對含量表達

3 討論

抑郁癥的病因至今尚未徹底闡明，目前認為，長期慢性、低水平的應激源是促進抑郁發(fā)生、發(fā)展的主要原因。慢性不可預知性大鼠應激模型就是根據(jù)此理論建立的，這一模型已成為國內外學者探討抑郁癥發(fā)病機制和抗抑郁藥作用機制而廣泛應用的動物模型。前期實驗證明頭穴叢刺法可以明顯改善慢性抑郁模型大鼠的行為學改變[6]，與本實驗結果一致，并且與陽性對照組鹽酸氟西汀組比較，開野實驗未見明顯差別，提示頭穴叢刺在提高模型大鼠活動度與求知度方面可達到與西藥鹽酸氟西汀類似效果。

應激是機體對外界傷害性環(huán)境變化的反應，短時間應激反應可使機體渡過難關、危險以適應環(huán)境變化，但長時間過度應激刺激會造成機體功能紊亂，出現(xiàn)對周圍事物的興趣降低、食欲減退、生存欲望低、學習記憶能力下降等癥狀，CRF作為一種應激激素和腦發(fā)育中關鍵的神經調節(jié)物質，主要刺激垂體前葉釋放促腎上腺皮質激素。當機體長期處于應激狀態(tài)時，HPA軸功能持續(xù)亢進，CRF釋放增加，腎上腺皮質激素分泌增加，機體可出現(xiàn)抑郁癥狀[7]。CRF神經元主要位于下丘腦，本研究發(fā)現(xiàn)慢性應激模型大鼠下丘腦內CRF陽性細胞比及下丘腦CRFmRNA相對含量表達均較正常對照組明顯升高，證明長期慢性應激刺激可造成大鼠腦內CRF表達增加同時伴隨行為學改變，并且與行為學改變正向相關，頭穴叢刺可以明顯降低大鼠腦內CRF的表達，并糾正大鼠行為學的改變，效果接近陽性對照組鹽酸氟西汀組。證明頭穴叢刺抗抑郁作用可能與干預調整因長期慢性應激刺激造成的CRF增高有關，為今后針刺抗抑郁機理研究提供依據(jù)。

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