馬明明，楊家彪，蘇新科

(西安工程大學(xué)環(huán)境與化工學(xué)院，陜西西安 710048）

絲素肽 (SP)是絲素蛋白水解后的大分子多肽物質(zhì)，含有18種氨基酸，生物相容性優(yōu)異［1］，作為添加劑可以改善產(chǎn)品的性能，在印染工業(yè)、食品、化妝品、醫(yī)藥等［2－3］等領(lǐng)域有較多應(yīng)用。特別是添加到印染體系后，可以顯著提高織物的染色指標(biāo)［4－5］。然而，并沒有絲素肽與染色織物的染料小分子結(jié)合機(jī)理的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此開展染料小分子結(jié)合絲素肽的工作就十分必要。

活性深藍(lán)M－2GE(RDBMG)是雙偶氮熒光鈉鹽染料，適用于滌棉、滌黏染色［6］，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。熒光光譜法簡(jiǎn)單，靈敏，依據(jù)熒光峰位或強(qiáng)度的變化可迅速判斷兩組分是否有相互作用，進(jìn)一步推算出二者的結(jié)合機(jī)制。本文應(yīng)用熒光光譜法研究了活性深藍(lán)M－2GE對(duì)絲素肽在305nm處熒光的猝滅，探討了猝滅機(jī)理，紫外可見、同步熒光光譜也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。印染工藝中常見物質(zhì)紡織淀粉、氨基酸、離子液體、氧化劑、表面活性劑、金屬離子對(duì)二者結(jié)合體系有不同的影響，為今后絲素肽在活性深藍(lán)M－2GE印染體系中的工藝條件選擇提供了依據(jù)。

圖1 RDBMG的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structural formula of RDBMG

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(jì) (RF－5301PC，日本島津);紫外可見分光光度計(jì) (UV－2450，日本島津);三用恒溫水浴箱 (H－60，國(guó)華化學(xué)儀器);1×10－4mol/L、1 ×10－3mol/L 活性深藍(lán) M－2GE(江蘇申新)，儲(chǔ)備液;1.0 g/L絲素肽 (浙江絲綢科技研究有限公司)儲(chǔ)備液;溴化－1－己基－2，3－二甲基咪唑 (上海成捷化學(xué)有限公司);1－乙基－2，3－甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺鹽 (上海成捷化學(xué)有限公司);氯化羥乙基三甲基胺 (上海成捷化學(xué)有限公司);磷酸氫二鈉 (天津市登峰化學(xué)試劑廠);磷酸二氫鈉 (天津市博迪化工有限公司);原淀粉、聚丙烯醛胺、醛酸酯淀粉、氧化淀粉和磷酸酯淀粉漿料 (西安工程大學(xué)紡織材料學(xué)院);L－組氨酸、L－天冬氨酸、L－賴氨酸、L－精氨酸、L－甲硫氨基酸、L－白氨酸、L－脯氨酸、L－苯丙氨酸、L－絲氨酸、L－蘇氨酸 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為原子級(jí)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在一系列25 mL比色管中，分別加入0.26 g/L絲素肽、2 mL B.R.(pH 6.37)緩沖溶液和一定量體積的1×10－4mol/L活性深藍(lán)M－2GE，用水稀釋至刻度，搖勻，室溫下靜置10 min;將待測(cè)溶液倒入石英比色皿，置于樣品室，發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度均為5 nm，在熒光光度計(jì)上記錄熒光發(fā)射光譜。在熒光猝滅實(shí)驗(yàn)中，激發(fā)波長(zhǎng)選擇275 nm，掃描范圍為280～400 nm，在305 nm峰位記錄熒光強(qiáng)度。同步熒光光譜測(cè)定中Δλ=15 nm(其中λem=280 nm，λex=265 nm)和 Δλ =60 nm(λem=280nm，λex=220 nm)，Δλ =λem－λex，并在紫外可見分光光度計(jì)上掃描 (220～800 nm)吸收光譜;同步熒光掃描中λem=λex=275 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 RDBMG與SP作用機(jī)制

2.1.1 RDBMG與SP相互作用的熒光光譜特征

采用單因子輪換法，對(duì)RDBMG猝滅SP熒光強(qiáng)度的條件如SP濃度、結(jié)合時(shí)間、緩沖溶液種類及其pH等進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，當(dāng)SP濃度為0.26 g/L，作用時(shí)間為10 min，B.R.緩沖溶液 pH為6.37時(shí)，RDBMG對(duì)SP熒光強(qiáng)度猝滅條件最佳。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，研究了RDBMG猝滅SP熒光強(qiáng)度原理。圖2是295 K在不同濃度RDBMG存在下，SP熒光強(qiáng)度F與RDBMG濃度 (［Q］)的F0/F～［Q］關(guān)系圖。由圖可見，隨著RDBMG濃度的增加，F(xiàn)0/F 不斷增大，在 1.0×10－6～2.0×10－5mol/L范圍內(nèi)，F(xiàn)0/F與 ［Q］并不是全呈線性關(guān)系;當(dāng) RDBMG濃度大于1.4×10－6mol/L時(shí)，曲線向上彎曲，說明SP與RDBMG作用后，使SP的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅。猝滅有靜態(tài)、動(dòng)態(tài)猝滅或二者兼而有之。對(duì)動(dòng)態(tài)猝滅，遵循 Stern－Volmer［7］等式:F0/F=1+Kqτ0［Q］=1+KSV［Q］，F(xiàn)0、F分別是SP在加入猝滅劑 (RDBMG)前后的熒光強(qiáng)度，Kq是生物大分子的熒光猝滅速率常數(shù)，τ0是無(wú)猝滅劑時(shí)SP的平均壽命，KSV是動(dòng)力學(xué)猝滅常數(shù)，［Q］是猝滅劑的濃度。τ0取10－8s。計(jì)算出不同溫度下的Kq均大于生物大分子的限制擴(kuò)散系數(shù) 2 ×1010L·mol－1·s－1［8－9］，說明 RDBMG 引發(fā)SP猝滅不是動(dòng)力學(xué)碰撞，而是二者結(jié)合為配合物后使其熒光猝滅。對(duì)靜態(tài)猝滅，符合等式:lg ［(F0－F)/F］=lg K+nlg ［Q］［8］，其中 KA是猝滅劑與生物大分子的結(jié)合常數(shù)，n是猝滅劑與每個(gè)生物大分子的結(jié)合點(diǎn)數(shù)，［Q］是猝滅劑濃度。研究發(fā)現(xiàn)在295～318 K的溫度范圍內(nèi)，隨溫度增加，RDBMG與SP結(jié)合常數(shù)出現(xiàn)先逐漸減小后增大，但結(jié)合位點(diǎn)數(shù)基本不變，大約為1。

圖2 295 K溫度下RDBMG+SP結(jié)合體系熒光光譜曲線及Stern－Volmer曲線Fig.2 The fluorescence spectrum of SP+RDBMG at 295K and Stern－Volmer plot

根據(jù) F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論［10］，能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)不僅與給體與受體之間的距離有關(guān)，還與臨界轉(zhuǎn)移距離R0有關(guān)。其中，能量轉(zhuǎn)移效率E與R0之間存在下列等式:E=，E=1 －F/F0=8.8 × 10－25Κ2Ν－4Φ J，r為熒光給體與受體結(jié)合距離，K2為偶極子空間定向因子，N為介質(zhì)的折射指數(shù)，Φ為熒光給體熒光量子產(chǎn)率，J為給體熒光光譜和受體紫外－可見吸收光譜的重疊積分。光譜重疊積分符合下列關(guān)系

F(λ)是給體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度，ε(λ)是受體在波長(zhǎng) (處的摩爾吸收系數(shù)。圖3是SP熒光發(fā)射光譜 (1)和RDBMG(2)紫外可見光譜重疊圖，在圖中通過OriginPro7.5軟件計(jì)算J=3.46×10－14cm3·L·mol－1。已知 K2=2/3，N=1.336，Φ =0.15［11］，算得 R0=3.14 nm，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) IF=414.232，=918.35 ，得 E=0.55 代入 (1)式，r=3.04 nm。SP與 RDBMG 作用距離 r=3.04 nm，小于7 nm，符合非輻射能量轉(zhuǎn)移條件，說明能量由SP轉(zhuǎn)移給RDBMG的概率非常大，因此RDBMG對(duì)SP的的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

圖3 SP熒光光譜 (1)和RDBMG紫外吸收光譜 (2)的重疊圖ig.3 The overlay of the fluorescence emission spectrum of SP(1)and the absorption spectrum of RDBMG(2)

2.1.2 RDBMG與SP相互作用的紫外光譜 由于動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑與激發(fā)態(tài)分子碰撞作用，對(duì)吸收光譜無(wú)影響，而靜態(tài)猝滅是與基態(tài)分子作用，形成締合物，會(huì)引起吸收光譜的改變。考察了SP+RDBMG體系的紫外吸收光譜。圖4是1×10－5mol/L RDBMG和0.26 g/L SP以及兩者混合時(shí)的紫外吸收光譜。

圖4 RDBMG與SP的紫外光譜圖Fig.4 The absorption spectrum of RDBMG and SP

由圖4知，SP在275 nm處有一吸光度比較小，RDBMG在295 nm處有一峰，兩者混合后，0.18 g/L SP在275 nm處的峰完全消失，當(dāng)加大SP濃度到0.50 g/L時(shí)，由于SP過量造成，在275 nm又出現(xiàn)SP峰 (圖中曲線5);同時(shí)SP在205 nm處峰紅移至218 nm處，以上可說明二者發(fā)生反應(yīng)。

2.1.3 同步熒光光譜 同步熒光光譜通?？梢蕴骄康鞍踪|(zhì)構(gòu)象的變化。當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)，同步熒光光譜顯示蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的熒光;若Δλ=60 nm，則為蛋白質(zhì)色氨酸殘基的熒光。由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸殘基的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)與其所處的環(huán)境的極性有關(guān)，因此，根據(jù)最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

圖5為RDBMG與SP相互作用的同步熒光光譜圖。由圖5(A)知，RDBMG的加入使SP酪氨酸殘基在最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度逐漸減小;由圖5(B)可以看出SP色氨酸殘基在最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度由于RDBMG的存在而逐漸減弱，290 nm處峰位沒有移動(dòng)，但327 nm處峰位出現(xiàn)紅移，因此RDBMG與SP結(jié)合改變了酪氨酸、色氨酸殘基所處的環(huán)境。

圖5 RDBMG+SP體系的同步熒光譜圖Fig.5 The sychronous fluorescence spectra of RDBMG+SP

2.2 印染工藝中常用物質(zhì)對(duì)RDBMG結(jié)合SP的影響

2.2.1 表面活性劑對(duì)RDBMG結(jié)合SP的影響 表面活性劑可以改善染料的溶解度和染色性能，提高勻染性、上染速率和染色牢度［11－12］。當(dāng)結(jié)合體系中存在曲拉通X－100、十二烷基苯磺酸鈉、CTAB等表面活性劑時(shí)，結(jié)合常數(shù)由3.37×105分別變?yōu)?.56×106、1.85 ×106和 3.55 ×106?？梢?，無(wú)論是哪種類型的表面活性劑，均能使結(jié)合體系結(jié)合常數(shù)增加，且增加倍數(shù)超過5倍。這與表面活性劑在體系中形成膠束，增強(qiáng)RDBMG溶解度，使RDBMG小分子更易于進(jìn)入SP肽鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.2.2 常用氧化劑對(duì)結(jié)合體系的影響 染色工藝中，染料隱色體以鈉鹽形式存在，在染色后需要在氧化劑作用下生成不溶性的染料，恢復(fù)染料原來的顏色，在此過程中，選擇氧化劑的種類和用量非常重要，均對(duì)染色深淺和色光影響較大，氧化不足造成色淺，氧化過度染色加深，色光暗。試驗(yàn)了K2S2O8、K2Cr2O7、H2O2三種氧化劑對(duì)結(jié)合參數(shù)的影響。結(jié)果顯示三種氧化劑的存在并沒顯著改變結(jié)合位點(diǎn)，但使結(jié)合常數(shù)變小，即由原來的結(jié)合常數(shù)3.37 ×105分別變?yōu)?0.15 ×105、2.04 ×105、2.89×105;且氧化劑氧化性越強(qiáng)，結(jié)合常數(shù)減小越明顯。這主要是由于氧化劑可氧化肽鏈氨基酸殘基［13］，破壞發(fā)色基，將發(fā)色基變?yōu)榭山到饨Y(jié)構(gòu)，從而使染料與絲素肽的結(jié)合力下降造成的。

2.2.3 金屬離子對(duì)結(jié)合體系的影響 金屬離子在紡織領(lǐng)域主要表現(xiàn)在染色、對(duì)絲素蛋白的作用、真絲的改性和防脆化處理以及抗菌、消臭、助燃、導(dǎo)電和防電磁波輻射等作用上［14］。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)金屬離子是通過形成空雜化軌道以接受纖維或織物上氨基、羧基、羥基、氰基等極性基團(tuán)的孤對(duì)電子，通過配位鍵形成絡(luò)合物。其中，在與蛋白質(zhì)纖維絡(luò)合時(shí)，一個(gè)中心金屬離子還可以與多個(gè)氨基酸形成環(huán)狀絡(luò)合物，且絡(luò)合物形成的環(huán)數(shù)愈多配位愈多，絡(luò)合鹽的穩(wěn)定性愈好。Ca2+、Zn2+、Ba2+、Cu2+四種離子分別存在時(shí)對(duì)結(jié)合常數(shù)有不同的影響。除了Cu2+使結(jié)合常數(shù)變小外，其他三種離子都使其增大。Ca2+、Zn2+、Ba2+與SP存在螯合作用，誘導(dǎo)SP的結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則的SilkⅠ向 β－折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變［15］，形成相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，增強(qiáng)RDBMG與SP的結(jié)合，但Cu2+還可以與 RDBMG上的－形成鍵能較大的化學(xué)鍵，封閉了染料的水溶性基團(tuán)，導(dǎo)致RDBMG與SP結(jié)合減弱，結(jié)合常數(shù)會(huì)減小。

2.2.4 離子液體對(duì)結(jié)合體系的影響 離子液體作為良好的溶劑，常用作染料的分散劑，蠶絲、纖維素和羊毛的再生紡絲溶劑，苧麻和羊毛纖維的改性試劑以及用于染色廢水處理［16］等。試驗(yàn)了三種離子液體溴化－1－己基－2，3－二甲基咪唑、1－乙基－2，3－甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺、氯化羥乙基三甲基胺對(duì)結(jié)合體系的影響，結(jié)果見表1。離子液體的存在大幅增加結(jié)合常數(shù)，說明具有優(yōu)良溶解性能的離子液體增強(qiáng)SP和RDBMG親水結(jié)合環(huán)境，使SP和RDBMG更易結(jié)合。

表1 室溫下離子液體存在下SP－RDBMG體系的靜態(tài)猝滅方程Table 1 Static quenching equation of SP－RDBMG – ionic liquids system at room temperature

2.2.5 紡織漿料對(duì)結(jié)合體系的影響 紡織漿料是使紗條表面光滑、耐磨、柔韌且有一定強(qiáng)度的漿膜。可以使紗條表面的纏繞纖維緊貼紗條的主干，降低紗條表面的摩擦系數(shù)，同時(shí)使部分漿液滲入紗線內(nèi)部，增加纖維之間的黏付力，提高紗線的抗拉強(qiáng)度，以適應(yīng)織造過程中的大張力、中打緯，減少斷頭提高效率。常見漿料以淀粉為主要原料。本文試驗(yàn)了幾種不同結(jié)構(gòu)的漿料對(duì)結(jié)合體系靜態(tài)猝滅方程的影響。聚丙烯醛胺和醋酸酯淀粉結(jié)構(gòu)復(fù)雜，空間位阻較大，在結(jié)合體系存在時(shí)會(huì)阻礙SP與RDBMG結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)下降。而原淀粉、磷酸酯淀粉、氧化淀粉結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，官能團(tuán)之間交聯(lián)程度小，能促進(jìn)SP表面活性位點(diǎn)增多，有利于RDBMG的結(jié)合，因此這三種淀粉存在時(shí)結(jié)合體系結(jié)合常數(shù)增加。

2.2.6 氨基酸對(duì)結(jié)合體系的影響 氨基酸是兩性物質(zhì)，含有—COOH和—NH2，在染色體系中能改善染料染色性能。本文試驗(yàn)了11種不同氨基酸對(duì)SP結(jié)合RDBMG的影響。L－苯丙氨酸、L－絲氨酸、L－蘇氨酸和甘氨酸能夠降低SP與RDBMG的結(jié)合常數(shù);而L－天冬氨酸、L－組氨酸、L－賴氨酸、L－精氨酸、L－甲硫氨基酸、L－白氨酸、L－脯氨酸則使二者結(jié)合常數(shù)增大，其中L－白氨酸使結(jié)合常數(shù)增加最大，比最初的結(jié)合常數(shù)高約30倍。這與氨基酸的性能密切相關(guān)。L－苯丙氨酸、L－絲氨酸、L－蘇氨酸和甘氨酸的親水性差，導(dǎo)致RDBMG不易和SP結(jié)合;而其余幾種氨基酸親水性較好，有利于SP結(jié)合RDBMG，因此能提高結(jié)合常數(shù)。

3 結(jié)論

1)RDBMG與SP結(jié)合形成作用距離為3.04 nm、結(jié)合為1∶1的復(fù)合物后，以靜態(tài)猝滅方式猝滅SP內(nèi)源熒光，從而改變了酪氨酸、色氨酸殘基所處的環(huán)境，引起SP肽鏈構(gòu)象結(jié)構(gòu)縮聚變化。

2)表面活性劑、鹽類、氧化劑、離子液體、氨基酸和漿料能改善絲素的染色性能。實(shí)驗(yàn)表明三種表面活性劑CTAB、十二烷基苯磺酸鈉、曲拉通X－100有利于RDBMG與SP結(jié)合作用;雙氧水、K2S2O8和K2Cr2O7三種氧化劑對(duì)二者結(jié)合都不利，氧化性越強(qiáng)影響程度越大;CaCl2、Zn(NO3)2和BaCl2三種鹽都能使結(jié)合體系結(jié)合常數(shù)變大，由于Cu(NO3)2·3H2O能與RDBMG螯合導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)變小;離子液體溴化1－乙基－2，3－二甲基咪唑、1－乙基－2，3－甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺鹽、氯化羥乙基三甲基胺三種離子液體都較大程度增大了結(jié)合常數(shù)，在染色過程中可考慮加入此類離子液體;原淀粉、磷酸酯淀粉、氧化淀粉都有利于RDBMG與SP結(jié)合，其中氧化淀粉對(duì)二者結(jié)合最有利，聚丙烯醛胺和醛酸酯淀粉漿料會(huì)減弱SP和活性深藍(lán)M－2GE的結(jié)合。11種氨基酸中，只有 L－苯丙氨酸、L－絲氨酸、L－蘇氨酸和甘氨酸使RDBMG與SP結(jié)合常數(shù)變小，因此體系中不宜含有這四種氨基酸。

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