張 影，賈立軍，薛書江，錢年超，張守發(fā)

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林 延吉133002）

附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體（Mycoplasma）寄生于多種動(dòng)物和人紅細(xì)胞表面及血漿、骨髓內(nèi)而引起的一種人獸共患病。目前，針對(duì)附紅細(xì)胞體病的診斷已建立了多種檢測(cè)技術(shù)，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、熒光抗體試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等血清學(xué)技術(shù)已用于檢測(cè)附紅細(xì)胞體抗體［1－3］。但國(guó)內(nèi)外比較公認(rèn)的是檢測(cè)到病原體的存在，常用的方法有姬姆薩染色鏡檢病原體和PCR檢測(cè)核酸的方法，Gwaltneys等證實(shí)PCR方法是進(jìn)行附紅細(xì)胞體病診斷和研究的一種有價(jià)值的方法，而且具有較高的特異性和敏感性［4－6］。本試驗(yàn)選擇了豬附紅細(xì)胞體熱休克蛋白DnaJ基因建立豬附紅細(xì)胞體病PCR診斷方法，旨在為豬附紅細(xì)胞體病的快速診斷建立準(zhǔn)確、特異、敏感的檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 血樣來(lái)源 豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血樣由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存，53份待檢豬血液樣品采自吉林省延邊地區(qū)。

1.2 試劑 血液基因組DNA提取試劑盒、dNTP、ExTaq酶、瓊脂糖、DNA Marker 2 000等，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬附紅細(xì)胞體（豬支原體 NC＿015153.1）全基因組序列中DnaJ基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)特異的引物D1和D2，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

引物序列為：上游D1：5′－ATCATCCCGACATTAACAA－3′；下游 D2：5′－CCCATTCCCTTTAGT－TTCA－3′。

1.4 附紅細(xì)胞體DNA的提取 豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血樣基因組DNA按照全血基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 PCR擴(kuò)增、退火溫度的篩選 以提取的豬附紅細(xì)胞體DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火溫度梯度為53℃～59℃45s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。

1.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、鑒定與測(cè)序 將868 bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段按照DNA提取試劑盒說(shuō)明對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后，將回收的目的片段克隆連接到pMD18－T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在氨芐平板上篩選出陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆菌送往上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.7 特異性試驗(yàn) 分別以犬新孢子蟲、牛附紅細(xì)胞體、犬附紅細(xì)胞體、牛瑟氏泰勒蟲的DNA為模板，按照最佳反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.8 敏感性試驗(yàn) 用紫外分光光度儀測(cè)定上述提取的豬附紅細(xì)胞體DNA的OD260nm值，計(jì)算DNA含量。以10倍為梯度連續(xù)稀釋成6個(gè)不同濃度，用最佳反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以此來(lái)確定PCR方法的敏感性。

1.9 DnaJ基因PCR與姬姆薩染色鏡檢的比較 將采自吉林省延邊地區(qū)的53份待檢豬血液樣品，進(jìn)行DnaJ基因PCR檢測(cè)，同時(shí)與姬姆薩染色鏡檢進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增 以豬附紅細(xì)胞體DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出大小為868bp的基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

2.2 最適退火溫度的篩選 對(duì)豬附紅細(xì)胞體DNA進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，在56℃時(shí)條帶最亮，將56℃定為最佳退火溫度（圖2）。

2.3 陽(yáng)性質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果如圖3所示，下劃線位置為引物位置，序列分析表明與GenBank中（NC＿015153.1）同源性為99%。

2.4 特異性試驗(yàn) 以豬附紅細(xì)胞體、犬新孢子蟲、牛附紅細(xì)胞體、犬附紅細(xì)胞體、牛瑟氏泰勒蟲的DNA為模板，以D1、D2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，只有豬附紅細(xì)胞體在868bp處擴(kuò)增出了特異性條帶，其他樣品無(wú)特異性條帶（圖4），說(shuō)明該方法具有較好的特異性。

2.5 敏感性試驗(yàn) 取PCR檢測(cè)為豬附紅細(xì)胞體病陽(yáng)性血液DNA，按101～106進(jìn)行倍比稀釋，用D1、D2引物對(duì)不同稀釋倍數(shù)的DNA依次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，樣品經(jīng)稀釋后，經(jīng)PCR擴(kuò)增能檢出106倍稀釋的DNA，此時(shí)DNA的濃度值為124fg/μL。

2.6 DnaJ基因PCR與姬姆薩染色鏡檢的比較以53份豬血液樣本DNA為模板，進(jìn)行DnaJ基因PCR擴(kuò)增，與姬姆薩染色鏡檢結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，檢測(cè)的53份血液樣本，DnaJ基因PCR方法的豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性檢出率為86.8%（46/53），姬姆薩染色鏡檢方法的豬附紅細(xì)胞體的陽(yáng)性檢出率為15.1% （8/53），其中染色鏡檢為陽(yáng)性的血液樣本，PCR檢測(cè)也均為陽(yáng)性（表1）。

表1 DnaJ基因PCR擴(kuò)增和姬姆薩染色鏡檢方法的比較

3 討論

近年來(lái)，由于附紅細(xì)胞體病具有廣泛的流行性、高度的感染性，該病的感染動(dòng)物數(shù)量和種類也呈上升趨勢(shì)［7－8］。有關(guān)附紅細(xì)胞體病的病原學(xué)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)的研究已取得了一定進(jìn)展，其中PCR方法具有快速、敏感、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，對(duì)豬附紅細(xì)胞體病的檢測(cè)具有高度的特異性和敏感性，對(duì)隱性感染豬群具有良好的檢測(cè)效果。本試驗(yàn)經(jīng)對(duì)53份現(xiàn)地血液樣品的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCR檢測(cè)則為陽(yáng)性率高于姬姆薩染色鏡檢陽(yáng)性率，說(shuō)明本試驗(yàn)建立的PCR檢測(cè)方法比染色鏡檢方法更為敏感，能夠檢測(cè)到豬附紅細(xì)胞體病的隱性感染，為提早的預(yù)防和治療該病提供了重要的參考價(jià)值。

本試驗(yàn)基于豬附紅細(xì)胞體DnaJ基因的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出約868bp大小的基因片段，并進(jìn)行PCR條件的優(yōu)化，建立了豬附紅細(xì)胞體DnaJ基因PCR檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)血涂片姬姆薩染色鏡檢和PCR方法對(duì)53份血樣進(jìn)行豬附紅細(xì)胞體的檢測(cè)比較，結(jié)果PCR檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率明顯高于姬姆薩染色鏡檢，進(jìn)一步證明了PCR檢測(cè)方法的靈敏度高，更適合對(duì)豬附紅細(xì)胞體的檢測(cè)。

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