黃國(guó)勝

PTEN是一種抑癌基因，其與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。4EBP1和S6K1為PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的下游因子。4EBP1為翻譯抑制蛋白，它能調(diào)節(jié)eIF4E的活性影響蛋白質(zhì)的翻譯［1］。S6K1具有磷酸化作用，通過磷酸化S6蛋白來調(diào)控5’TOPmRNA翻譯蛋白的起始，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，加快細(xì)胞生長(zhǎng)。PTEN是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，為探討抑制PTEN后對(duì)食管癌EC-1細(xì)胞4EBP1、S6K1表達(dá)的影響，本研究采用反義寡核苷酸技術(shù)利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于食管癌EC-1細(xì)胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)4EBP1和S6K1的蛋白表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人食管癌EC-1細(xì)胞株(香港大學(xué)曹世華教授惠贈(zèng));10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自四季青公司;Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;全硫代修飾PTEN ASODN(5’GTTCGTCCCTTTCCAGCTTTACA 3’)由上海生工合成;兔抗人4EBP1多克隆抗體、兔抗人S6K1多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;PV-9000二步法免疫組化檢測(cè)試劑購(gòu)自中杉金橋;

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分組培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇后的EC-1細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后以細(xì)胞數(shù)5.6×104個(gè)/孔種于6個(gè)24孔板培養(yǎng)。每板分終濃度為3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L的ASODN實(shí)驗(yàn)組，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的為對(duì)照組，每組設(shè)12個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后按照Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑使用說明，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染終濃度為3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L 的 ASODN 分別培養(yǎng) 24、48、72 h。

1.2.2 細(xì)胞標(biāo)本制備 分別撈出作用24 h、48 h、72 h的24孔板中長(zhǎng)滿細(xì)胞的載玻片，晾干、固定、4℃保存。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)的主要步驟 將待檢測(cè)的各組標(biāo)本水化，4EBP1和S6K1抗體以1:100稀釋后按照PV-9000二步法免疫組化檢測(cè)試劑使用說明和ZLI-9031/9032/9033濃縮型DAB試劑盒使用說明進(jìn)行操作。

1.2.4 對(duì)照組設(shè)計(jì) 轉(zhuǎn)染終濃度為3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L的ASODN為實(shí)驗(yàn)組，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的為對(duì)照組。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判定 免疫細(xì)胞化學(xué):以PBS代替一抗作陰性對(duì)照;用已知的4EBP1和S6K1陽性表達(dá)的乳腺癌組織作陽性對(duì)照。4EBP1和S6K1免疫細(xì)胞化學(xué)陽性信號(hào)位于細(xì)胞漿，呈棕黃色。每張標(biāo)本高倍鏡下觀察10個(gè)視野，采用十三點(diǎn)評(píng)分法，最終評(píng)分是兩個(gè)指標(biāo)的乘積［2］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，兩組以上均數(shù)比較用方差分析，方差不齊時(shí)先進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換，α=0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

PTEN ASODN對(duì)食管癌EC-1細(xì)胞4EBP1和 S6K1蛋白表達(dá)的影響見表1、2。4EBP1和S6K1的免疫細(xì)胞化學(xué)陽性信號(hào)均位于EC-1細(xì)胞的胞漿，呈棕黃色。每張標(biāo)本高倍鏡下觀察10個(gè)視野，顯示轉(zhuǎn)染PTEN的ASODN于EC-1細(xì)胞后隨濃度和時(shí)間增加4EBP1蛋白表達(dá)降低而S6K1蛋白表達(dá)增強(qiáng)，在同一時(shí)間不同濃度和同一濃度不同時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在12μmol/L 、72 h作用最強(qiáng)。

表1 轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于EC-1細(xì)胞4EBP1蛋白的表達(dá)(±s)

表1 轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于EC-1細(xì)胞4EBP1蛋白的表達(dá)(±s)

注:ASODN組在同一時(shí)間不同濃度和同一濃度不同時(shí)間兩兩相比以及與對(duì)照組相比P＜0.05

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表2 轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于EC-1細(xì)胞S6K1蛋白表達(dá)(±s)

表2 轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于EC-1細(xì)胞S6K1蛋白表達(dá)(±s)

注:ASODN組在同一時(shí)間不同濃度和同一濃度不同時(shí)間兩兩相比以及與對(duì)照組相比P＜0.05

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3 討論

P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路包括 PI3K、PTEN、AKT、mTOR、4EBP1、S6K1等因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中與多個(gè)細(xì)胞生物學(xué)環(huán)節(jié)有關(guān)，包括細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、血管新生以及細(xì)胞周期調(diào)控等方面，并影響著腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移［3］，研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因突變、缺失和甲基化等遺傳學(xué)改變存在于許多腫瘤中，提示PTEN基因異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用［4］。PTEN蛋白可以逆轉(zhuǎn)PI3K所催化的反應(yīng)，使PIP3去磷酸化為PIP2，降低PIP3濃度而對(duì)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)調(diào)控作用。當(dāng)它發(fā)生突變時(shí)PIK3/AKT通路活性增強(qiáng)，下游mTOR的活性也隨之增強(qiáng)，從而抑制4E-BP1的合成、促進(jìn)S6K1的合成。PTEN ASODN使PTEN基因沉默、功能缺失而使PI3K產(chǎn)物增加、Akt組成性活化，導(dǎo)致mTOR信號(hào)途徑的上調(diào)，抑制4E-BP1的功能和促進(jìn)了核糖體蛋白P70S6K的合成蛋白作用，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。

［1］王曉麗，黃娟，李林，等.真核細(xì)胞翻譯起始因子eIF4E的研究進(jìn)展.華西醫(yī)學(xué)，2009.24(3):787-788.

［2］何華.如何讓正確的對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量評(píng)分.中外健康文摘.臨床醫(yī)師，2008，5(7):162.

［3］孟艷，米蕊芳，趙春華.PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞分化中的作用.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27(12):1404-1408.

［4］Dehia PL.PTEN，a unique tumor suppressor gene.Endocr Relat Cancer，2000，7(1):115-129.