何振輝，翁閃凡，何太平，覃燕梅，梁念慈

1)佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系 佛山 528000 2)廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所 湛江 524023 3)廣東省天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湛江 524023

半邊旗(PterissemipinnataL, PsL)又名半邊蕨、半邊梳，為鳳尾蕨科鳳尾蕨屬植物，廣泛分布于南方各省，民間常用于清熱解毒、消腫止痛。5F是作者所在的課題組從PsL中提取的二萜類化合物，化學(xué)名為11α-羥基-15-氧-16-烯-ent-貝殼杉烷-19酸，分子式為C20H28O4，相對(duì)分子質(zhì)量為332.4。以往的研究[1-2]表明，5F能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。何太平等[3-4]發(fā)現(xiàn)5F影響高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM多種癌相關(guān)基因尤其是P53、Nr1d1的表達(dá)。作者以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為受試對(duì)象，研究5F對(duì)高轉(zhuǎn)移乳癌細(xì)胞MDA-MB-231培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC血管生成潛能的影響，并分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料HUVEC、MDA-MB-231細(xì)胞分別購(gòu)自美國(guó)Cascade Biologics公司和美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，MTT購(gòu)自Amresco公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，PVPF濾膜(孔徑8 μm，直徑13 mm)購(gòu)自O(shè)smonics公司，F(xiàn)ibronectin、Matrigel購(gòu)自BD公司。KDR小鼠IgG單抗、Flt-1小鼠IgG單抗、β-actin山羊IgG多抗購(gòu)自Santa Cruz公司，使用時(shí)以TBST溶液按1(1 000～2 000)稀釋；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、兔抗山羊IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，使用時(shí)以TBST溶液按1(4 000～10 000)稀釋。5F由廣東醫(yī)學(xué)院天然藥物開(kāi)發(fā)中心提供，實(shí)驗(yàn)前以DMSO溶解，培養(yǎng)液稀釋。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物的制備MDA-MB-231細(xì)胞、HUVEC分別培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。

取生長(zhǎng)良好的MDA-MB-231，棄去培養(yǎng)液，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 收集上清，即為乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物，過(guò)濾除菌，備用。

1.3HUVEC增殖抑制實(shí)驗(yàn)采用MTT法。參照文獻(xiàn)[5]，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC,確保細(xì)胞存活率在97%以上。細(xì)胞以(0.5～1.0)×105mL-1接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度條件下過(guò)夜，換乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物后，用藥組加入1 μL不同濃度5F，使5F終濃度為10、20、40、80、160 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，并設(shè)空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組及完全培養(yǎng)基調(diào)零孔，置孵箱中6、24 h后，每孔加入10 μL 5 g/L MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h。傾去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO溶解，于酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=(1-給藥組細(xì)胞吸光度值/對(duì)照組細(xì)胞吸光度值)×100%。

1.4乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC穿膜、趨化性運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定[6]將PVPF濾膜用指甲油貼在Transwell小室上，風(fēng)干；在膜的外表面涂10 μL纖連蛋白(5 μg)，置超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干，膜的內(nèi)表面涂10 μL Matrigel(5 μg)，干燥后形成人工重組基底膜。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，懸浮于1 g/L BSA-DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整密度為1×109L-1。將Transwell小室浸于24孔板(每孔預(yù)先加入600 μL 乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物)中，每個(gè)小室加入100 μL HUVEC懸液，同時(shí)加入20、40、80 μmol/L的5F 1 μL，對(duì)照組加入等量的PBS。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱內(nèi)孵育6 h。將Transwell小室取出，濾膜用甲醇固定1 min，蘇木素染色3 min，水洗，伊紅染色10 s，水洗，用生理鹽水浸濕的棉簽擦去濾膜內(nèi)表面的細(xì)胞；用封片膠將濾膜封于載玻片上，于高倍鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。每膜計(jì)數(shù)5個(gè)視野，每組平行設(shè)3個(gè)濾膜。趨化性運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定與上述實(shí)驗(yàn)相比，只是PVPF濾膜上不鋪 Matrigel，其余處理相同。抑制率=(1-給藥組穿膜或遷移細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組穿膜或遷移細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5HUVEC基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)96孔培養(yǎng)板每孔預(yù)鋪Matrigel，置超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干后用20 g/L BSA封閉1 h，PBS沖洗；收集預(yù)先經(jīng)20、40和80 μmol/L 5F處理24 h的以乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞，懸浮于含1 g/L BSA-DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為8×105mL-1，每孔加入100 μL，并設(shè)空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組及DMEM培養(yǎng)基調(diào)零孔。37 ℃培養(yǎng)1 h；棄培養(yǎng)液，以PBS輕輕沖洗3遍除去未黏附細(xì)胞；棄去PBS，每孔加入100 μL DMEM完全培養(yǎng)基和 50 μL 1 g/L MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h。傾去MTT，每孔加入150 μL DMSO溶解，振搖15 min，于酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處的吸光度。每組平行設(shè)3個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。黏附抑制率= (1-給藥組黏附細(xì)胞吸光度/對(duì)照組黏附細(xì)胞吸光度)×100%。

1.6各組細(xì)胞Flt-1和KDRmRNA的檢測(cè)[7]待HUVEC貼壁生長(zhǎng)后，加入乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物，再分別加入PBS、體積分?jǐn)?shù)0.1%DMSO和終濃度為20、40、80 μmol/L 5F，處理24 h后收集細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Flt-1上游引物5’-GAC TAGATAGCGTCACCAG-3’,下游引物5’-TAAGACT GCCAAAGATGTT-3’; KDR上游引物5’-AGGGTG GAGGTGACTGAG-3’, 下游引物5’-GAGTCAGT GGAGGTGGGA-3’; GAPDH上游引物5’-TCATT GACCTCAACTACATGGTTT-3’,下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。PCR反應(yīng)體系按試劑盒說(shuō)明配制，在Mx3000P實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min;94 ℃ 10 s,53 ℃ 20 s,72 ℃ 15 s,共循環(huán)40次。記錄各管Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Flt-1、KDR及GAPDH mRNA的表達(dá)量,以Flt-1/GAPDH及KDR/GAPDH作為Flt-1及KDR mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7各組細(xì)胞Flt-1和KDR蛋白的檢測(cè)細(xì)胞同1.6中分組處理24 h，收集，PBS洗滌后用預(yù)冷的細(xì)胞裂解液刮下，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 mL離心管中，冰育30 min后，于4 ℃，12 000g離心15 min，收集上清。取少量上清用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。Western blot的方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，以β-actin為內(nèi)參。溶劑對(duì)照組及不同劑量5F組Flt-1和KDR蛋白的相對(duì)表達(dá)量為各組相應(yīng)指標(biāo)與空白對(duì)照組的比值×100%。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SAS V8.1處理數(shù)據(jù)。采用2×7析因設(shè)計(jì)的方差分析比較處理不同時(shí)間各組細(xì)胞的增殖抑制率，余指標(biāo)采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 5F對(duì)乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC增殖的抑制作用見(jiàn)表1。5F對(duì)乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)HUVEC的增殖具有一定程度的抑制作用，并且抑制率均隨濃度和時(shí)間的增加而增加。20、40、80 μmol/L的5F在6 h內(nèi)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率均低于10%，且與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此在考察5F對(duì)HUVEC體外穿膜和趨化性運(yùn)動(dòng)能力的影響時(shí)，為了排除5F自身對(duì)細(xì)胞的毒性作用，選擇20、40、80 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)濃度。

表1 5F對(duì)乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC增殖的抑制作用 (n=3)

F組間=64.852，F(xiàn)時(shí)間=131.393，F(xiàn)交互=23.266，P<0.001；*：與空白對(duì)照組相比，P<0.05;△：與空白對(duì)照組相比，P<0.01。

2.2 5F對(duì)乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC穿膜能力、趨化性運(yùn)動(dòng)能力及黏附基質(zhì)能力的影響見(jiàn)圖1、2及表2。5F能明顯抑制乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC穿膜能力、趨化性運(yùn)動(dòng)能力及黏附基質(zhì)能力。

圖1 穿膜能力實(shí)驗(yàn)中黏附在PVPF膜上的HUVEC(×400)

圖2 趨化性運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)中黏附在PVPF膜上的HUVEC(×400)

表2 5F對(duì)乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC穿膜能力、趨化性運(yùn)動(dòng)能力及黏附基質(zhì)能力的影響 (n=3) %

*：與空白對(duì)照組相比，P<0.01。

2.3 5F對(duì)乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVECFlt-1、KDRmRNA和蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖3，表3、4。不同濃度的5F作用于乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC 24 h后， 細(xì)胞中Flt-1、KDR mRNA和蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)。

表3 各處理組HUVEC KDR、Flt-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 (n=3) ×10-4

*：與空白對(duì)照組相比，P<0.05。

圖3 5F對(duì)乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC KDR、Flt-1蛋白表達(dá)的影響

表4 各處理組HUVEC KDR、Flt-1 蛋白表達(dá)的比較 (n=3) %

*：與空白對(duì)照組相比，P<0.05。

3 討論

對(duì)于腫瘤血管生成抑制劑，一般可以用分子模型、細(xì)胞模型、組織器官模型來(lái)篩選和研究其作用機(jī)制。隨著內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，血管形成的許多過(guò)程都可以用血管內(nèi)皮細(xì)胞模型進(jìn)行研究，如血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤(rùn)、運(yùn)動(dòng)等[8]。該研究結(jié)果顯示5F具有抑制高轉(zhuǎn)移乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC體外增殖、穿膜、趨化性運(yùn)動(dòng)能力和黏附基質(zhì)能力。但體外有作用的物質(zhì)在體內(nèi)不一定有相同的作用，結(jié)合先前的研究[9]，下一步應(yīng)以具體的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)如構(gòu)建裸鼠乳癌模型來(lái)觀察5F抗腫瘤血管生成的作用。

腫瘤血管生成的首要環(huán)節(jié)是腫瘤血管生成因子與血管生成抑制因子失衡，血管生成表型形成。在諸多血管生成因子中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)居于中心地位[10]。VEGF與其受體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)作用。目前，VEGF受體(VEGFR)已發(fā)現(xiàn)有5種：VEGFR-1(Flt-1), VEGFR-2(KDR/Flk-1)， VEGFR-3(Flt-4)，NP-1和NP-2。Flt-1、KDR、Flt-4均是受體酪氨酸蛋白激酶；Flt-1、KDR是VEGF的主要受體，主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá), Flt-4主要存在于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞[11]。

KDR是VEGF最重要的受體，處于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游。Rastelli等[12]發(fā)現(xiàn)VEGFR-2在VEGF所誘導(dǎo)的血管生成和血管通透性中起主要作用。單獨(dú)使用KDR抑制劑就能阻斷VEGF和bFGF所誘導(dǎo)的血管生成。VEGF能通過(guò)Grb10上調(diào)KDR的表達(dá)?；罨腒DR能夠激活PI3K、PLC-γ，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管通透性增加；通過(guò)黏附斑激酶和Src的相互作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)，抑制其凋亡[13]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5F可下調(diào)乳癌細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC中KDR mRNA和蛋白的表達(dá)，這可能是5F抑制MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物(含有高分泌水平VEGF)引發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)、浸潤(rùn)基底膜等生物學(xué)作用的原因。

在VEGFR中，F(xiàn)lt-1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制目前還未明了?；蚯贸椒@示Flt-1缺乏的小鼠死于血管生成過(guò)多。Flt-1 mRNA的剪接可產(chǎn)生可溶性的Flt-1(sFlt-1)。sFlt-1跟VEGF結(jié)合后，不能發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。sFlt-1能抑制腫瘤血管生成。也有報(bào)道[14]認(rèn)為Flt-1能誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞遷移并分泌VEGF，因此Flt-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5F下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC中Flt-1的表達(dá)，這種作用究竟是促進(jìn)還是抑制HUVEC的血管生成潛能，尚待進(jìn)一步研究。

總之，該研究結(jié)果顯示，5F 能抑制MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)物誘導(dǎo)的HUVEC體外增殖、穿膜、趨化性運(yùn)動(dòng)能力和黏附基質(zhì)能力，其作用機(jī)制可能與5F下調(diào)HUVEC KDR mRNA和蛋白表達(dá)水平有關(guān)。結(jié)合課題組先前的研究[9,15]，提示5F具有開(kāi)發(fā)為腫瘤血管生成抑制劑的潛能。

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