畢躍琴，葉玉廷，王洋洋，孫軼群，王 盼，阿有梅，畢躍峰#

1)南陽市骨科醫(yī)院藥械科 南陽473000 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州450001

野菊花(Flos Chrysanthemi indici) 來源于菊科植物野菊的干燥頭狀花序[1]，性微寒，味苦辛，歸心肝二經(jīng)，具有疏風(fēng)清熱解毒的功效。近年來研究[2]表明野菊花對肝具有一定的保護(hù)作用。作者在前期研究[3-5]中發(fā)現(xiàn)野菊花的主要活性成分為萜類(以倍半萜為主)和黃酮類化合物，并通過工藝研究得到了3個(gè)萃取部位的提取物及其主要成分：FCI-A主要含萜類化合物，F(xiàn)CI-B富含萜類和黃酮類化合物，F(xiàn)CI-C主要含總黃酮化合物。作者觀察了野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠肝細(xì)胞蛋白合成及小鼠免疫功能的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量(20±2) g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。野菊花采自河南省信陽大別山地區(qū)，經(jīng)鄭州大學(xué)藥學(xué)院潘成學(xué)副教授鑒定為菊科植物野菊花的干燥頭狀花序，標(biāo)本存于鄭州大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室，標(biāo)本號(hào)201110。野菊花不同萃取部位FCI-A、FCI-B和FCI-C浸膏由作者所在實(shí)驗(yàn)室自行制備。羧甲基纖維素鈉(分析純)購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，1,2-丙二醇(分析純)購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-galn)購自美國Sigma公司，聯(lián)苯雙酯滴丸(bifendate pill，BP) 購自浙江萬邦藥業(yè)有限公司?？偟鞍?total protein，TP)測試盒、白蛋白(albumin，ALB)測試盒和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase， ALT)測試盒均購自南京建成生物工程研究所。CP214電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)，UV-2550分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)，Herolab UniCen MR離心機(jī)(德國Herolab公司)，318C Microplate Reader 雙波長酶標(biāo)儀(上海三科儀器有限公司)。

1.2藥物配制FCI-A、FCI-B、FCI-C以及陽性藥物BP以1,2-丙二醇和DMSO溶解后，添加10 g/L羧甲基纖維素鈉，各組藥物均含體積分?jǐn)?shù)20%丙二醇和體積分?jǐn)?shù)1% DMSO。所有藥物均現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠肝細(xì)胞蛋白合成的影響各組高、中、低劑量設(shè)計(jì)根據(jù)各部位毒性試驗(yàn)確定。96只雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為12組，每組8只，分別為正常組，模型組，F(xiàn)CI-A低、中、高劑量組(分別給予0.5、1.0、2.0 g/kg)、FCI-B低、中、高劑量組(分別給予0.75、1.50、3.00 g/kg)、FCI-C低、中、高劑量組(分別給予1.0、2.0、4.0 g/kg)，BP組(0.2 g/kg)。各給藥組按0.02 mL/(g·d)劑量灌胃給藥，正常組和模型組給予相應(yīng)體積的溶媒，連續(xù)灌胃給藥7 d。于末次給藥1 h后，除正常組腹腔注射等量生理鹽水外，其余各組均腹腔注射100 g/L D-galn(0.8 g/kg)，禁食不禁水，24 h后小鼠稱質(zhì)量，眼靜脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清,按照測試盒說明分別測定TP、ALB水平及ALT活性。頸椎脫臼處死各組小鼠，快速摘取肝、脾，生理鹽水洗去血跡，濾紙拭干，用分析天平稱取質(zhì)量，計(jì)算肝、脾指數(shù)[6]。

1.4野菊花不同萃取部位對小鼠免疫功能的影響

1.4.1 小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn) 另取88只小鼠隨機(jī)分為11組，每組8只。空白組，陽性對照組[醋酸潑尼松0.02 mg/(g·d)]，F(xiàn)CI-A、FCI-B及FCI-C低、中、高劑量組分別按 1、3、6 mg/(g·d)灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，尾靜脈注射印度墨水0.01 mL/g，于2 min和10 min后眼眶取血20 μL，加入2 mL 1 g/L Na2CO3溶液中，于630 nm處測吸光度值。常規(guī)方法計(jì)算廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)。

1.4.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 再取64只小鼠隨機(jī)分為8組，每組8只，F(xiàn)CI-B低、中、高劑量組，F(xiàn)CI-C低、中、高劑量組，空白組和陽性對照組同1.4.1中處理，連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)前48 h腹腔注射0.5 mL 10 g/L溶解淀粉作為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)物。末次給藥1 h后，每只小鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)2%的雞紅細(xì)胞懸液1 mL，輕揉腹部，使細(xì)胞液分散。間隔30 min處死小鼠。正中剪開腹壁皮膚，腹腔注射生理鹽水2 mL,轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1 min。吸出1 mL腹腔液, 分別滴于兩片載玻片上，置37 ℃恒溫箱內(nèi)30 min。以冰丙酮/甲醇(VV=11)固定15 min。40 g/L Giemsa染液染色3 min，蒸餾水漂洗，晾干。油鏡下鏡檢，計(jì)數(shù)吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞及被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)，常規(guī)方法計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用單因素方差分析比較各組小鼠肝、脾指數(shù)和血清TP、ALB水平及ALT活性及各免疫指標(biāo)的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠肝、脾指數(shù)的影響模型組小鼠肝、脾指數(shù)較正常組升高，而野菊花不同萃取部位組小鼠肝、脾指數(shù)較模型組不同程度地降低，其中FCI-A、FCI-B高劑量組小鼠肝、脾指數(shù)明顯降低，而FCI-C組小鼠脾指數(shù)明顯降低，趨于正常。見表1。

表1 野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠肝、脾指數(shù)的影響 %

#:與正常組相比，P<0.05；*:與模型組相比，P<0.05。

2.2野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠血清TP、ALB水平及ALT活性的影響模型組小鼠血清TP、ALB水平較正常組降低，ALT活性升高，而FCI-A和 FCI-B組小鼠血清TP、ALB水平較模型組升高，以FCI-B組更明顯(P<0.05)。見表2。

表2 野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠血清TP、ALB水平及ALT活性的影響

#: 與正常組相比，P<0.05；*:與模型組相比，P<0.05。

2.3野菊花不同萃取部位對小鼠體內(nèi)碳粒廓清功能的影響碳粒廓清實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FCI-B、FCI-C對吞噬指數(shù)有影響，F(xiàn)CI-A對吞噬指數(shù)無明顯影響。見表3。

表3 野菊花不同萃取部位對小鼠體內(nèi)碳粒廓清功能的影響

*:與空白組比較，P<0.05。

2.4野菊花不同萃取部位對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響與空白組比較，F(xiàn)CI-B、FCI-C低劑量組巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)升高，高劑量組巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)降低。見表4。

表4 野菊花不同萃取部位對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

*:與空白組比較，P<0.05。

3 討論

肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，在糖、脂類與蛋白質(zhì)等代謝中均有重要作用[7-8]。蛋白質(zhì)在機(jī)體內(nèi)具有運(yùn)輸、營養(yǎng)、凝血與抗凝血、免疫作用以及維持pH值與血液滲透壓等生理功能[9]。D-galn為肝細(xì)胞毒劑，競爭性與磷酸尿苷結(jié)合而抑制肝細(xì)胞核酸、糖蛋白與脂糖等的合成，從而使肝細(xì)胞受損。大劑量D-galn可引起嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷，且該損傷的病理學(xué)特征與人類病毒性肝炎極為相似[10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明肝損傷時(shí)，肝血竇內(nèi)淤血，中央靜脈回流受阻，門靜脈內(nèi)壓升高，可致脾臟充血，腫大，繼發(fā)脾功能亢進(jìn)。由此可見肝臟病變可波及脾，所以除肝指數(shù)外，該研究同時(shí)選取了脾指數(shù)作為檢測指標(biāo)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)CI-A、FCI-B可不同程度地降低肝損傷小鼠肝、脾指數(shù)，特別是脾指數(shù)，保護(hù)受損肝、脾組織。

血清內(nèi)主要的蛋白質(zhì)幾乎全部由肝臟制造，故測定血清蛋白的水平并分析其成分，可了解肝臟合成功能的狀態(tài)。肝臟合成的蛋白主要為ALB及大部分α、β球蛋白。急、慢性肝損傷時(shí)，血清TP濃度都會(huì)減少，但慢性損傷時(shí)，γ球蛋白常升高，致使TP水平變化不大，故單憑血清TP水平難以正確估測肝臟合成功能。肝臟合成ALB呈限速性，僅在體內(nèi)過量ALB丟失或被破壞的情況下，其合成速率才會(huì)增加。ALB一旦在肝細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，便經(jīng)高爾基體分泌入肝竇。肝損傷時(shí)，ALB的合成、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和釋放發(fā)生障礙，進(jìn)而引起血清ALB減少[11]。該實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)CI-A和FCI-B可以不同程度地提高肝損傷小鼠血清TP、ALB水平，尤以FCI-B作用更明顯，而FCI-C對提高肝損傷小鼠蛋白合成能力作用不明顯，提示增強(qiáng)肝蛋白合成功能的主要活性成分可能為萜類化合物，而黃酮類對其有一定的協(xié)同作用，值得進(jìn)一步研究。

ALT正常存在于肝細(xì)胞胞質(zhì)中，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生壞死，細(xì)胞膜破裂或肝細(xì)胞變形，細(xì)胞膜通透性增高時(shí)，血清ALT活性升高。ALT活性可反映肝細(xì)胞變性、壞死程度，為檢查肝功能損害的一個(gè)靈敏指標(biāo)[12]。該研究中，F(xiàn)CI 3個(gè)萃取部位某些劑量在一定程度上能降低肝損傷小鼠血清ALT活性。

小鼠體內(nèi)碳粒廓清、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)都是機(jī)體固有免疫功能的檢測指標(biāo)。小鼠體內(nèi)碳粒廓清實(shí)驗(yàn)顯示FCI-A對其影響較小，故巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)只測了FCI-B、FCI-C。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低劑量的FCI-B、FCI-C均能提高吞噬指數(shù)，高劑量FCI-B、FCI-C可降低吞噬指數(shù)，說明FCI-B、FCI-C對免疫具有雙向調(diào)節(jié)作用。關(guān)于免疫調(diào)節(jié)的量效關(guān)系，尚需進(jìn)一步深入研究。

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