黃 波 王曉東 郎賢平 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸外科，遼寧 錦州 121000)

小細(xì)胞肺癌約占全部肺癌的20% ～25%，其惡性程度高，發(fā)展迅速，早期可有遠(yuǎn)處廣泛的轉(zhuǎn)移，確診時70% ～90%病人已有臨床或亞臨床的淋巴或血行轉(zhuǎn)移，自然病程短。小細(xì)胞肺癌對放、化療敏感，近期療效好，緩解率可達(dá)65% ～90%，但90%以上患者治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲是治療失敗患者死亡的主要原因〔1〕，因此尋找新的途徑治療小細(xì)胞肺癌尤顯重要。由于目前發(fā)現(xiàn)的與小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因較為罕見，尋找新的小細(xì)胞肺癌差異表達(dá)基因，并確定其在小細(xì)胞肺癌中的作用，對于小細(xì)胞肺癌的診斷、預(yù)防和治療均具有重要意義。ABCE1基因?qū)貯TP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子基因亞家族，其蛋白位于細(xì)胞質(zhì)，分布于人體多處組織，能夠阻斷干擾素介導(dǎo)的2-5A/核糖核酸酶L細(xì)胞抗病毒通路，抑制細(xì)胞凋亡過程，并可能在促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞增殖分化方面發(fā)揮作用〔2〕。為進(jìn)一步觀察ABCE1基因?qū)π〖?xì)胞肺癌細(xì)胞株的侵襲及遷移能力的影響，筆者在構(gòu)建ABCE1基因SiRNA表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，將上述載體轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，觀察ABCE1基因?qū)π〖?xì)胞肺癌增殖、侵襲、遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446由中國科學(xué)院細(xì)胞庫引進(jìn)。新生小牛血清購于杭州四季青公司，RPMI 1640培養(yǎng)基和lipofect2000購于美國Invitrogen公司。RNAi-Ready pSIREN-DNR購自 TaKaRa公司。為穿梭載體，大小6.7 kb，于832～1 509 bp位置攜帶有紅色熒光蛋白報告基因，其兩端分別帶有BamH I和 EcoR I酶切位點(diǎn)。菌株JM109、DH5α均購于大連寶生物公司。引物設(shè)計、合成以及測序由大連寶生物公司完成。ABCE1-SiRNA-1，ABCE1-SiRNA-2為 RNA干擾序列，ABCE1-SiRNA-N為無意義干擾序列。

1.2 SiRNA載體構(gòu)建 將合成的ABCE1基因的SiRNA引物退火并將退火產(chǎn)物與RNAi-Ready pSIREN-DNR載體4℃過夜充分連接。熱轉(zhuǎn)化至DH5α中，分別命名為ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2、ABCE1-SiRNA-N，涂布平板后，37℃過夜培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化平板上挑取陽性單菌落，進(jìn)行擴(kuò)增，檢測陽性克隆，并測序。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，NCI-H446細(xì)胞用胰酶消化，接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%～70%融合時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染當(dāng)天更換為無胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)孔1 000 μl。取lipofect2000 10 μl，按照轉(zhuǎn)染試劑：DNA(μg)為 10∶2的比例加入構(gòu)建成功的載體DNA，混勻后室溫孵育30 min，加入到6孔板中培養(yǎng)，6 h后加入100 μl胎牛血清。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染成功后檢測各項指標(biāo)。

1.4 Western印跡鑒定沉默效果 收取部分細(xì)胞，加入預(yù)冷裂解緩沖液，剪碎，超聲勻漿，低溫超速離心。吸取上清液，Lowry法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠90 V電泳3 h后轉(zhuǎn)印。洗膜后1%BSA封閉非特異性抗原2 h。緩沖液洗膜，與一抗(1∶250)4℃孵育過夜。洗膜后與堿性磷酸酶標(biāo)記二抗(1∶200)室溫下孵育2 h。NBT/BCIP顯色，以NC膜上出現(xiàn)清晰的棕褐色條帶為陽性，終止顯色，漂洗并干燥后避光保存。

1.5 細(xì)胞增殖能力的檢測(MTT法)用0.25%的胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后24 h的4組細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染組、ABCE1-SiRNA-1組、ABCE1-SiRNA-2組及ABCE1-SiRNA-N組)，以含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液配置成單細(xì)胞懸液。以每孔2×103個細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積0.2 ml，每組細(xì)胞接種6個孔，并以培養(yǎng)液為空白對照，以接種后24、48、72、96 h為4個觀察時間點(diǎn)，共鋪4塊板。置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后取出其中一塊板，每孔加入 5 mg/ml的 MTT 20 μl，37℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清后每孔加入150 μl DMSO，并震蕩10 min使MTT充分溶解。用490 nm波長的酶標(biāo)儀，測定各孔的吸光度值(OD值)。

1.6 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力的檢測 將轉(zhuǎn)染后24 h 4組細(xì)胞進(jìn)行如下操作：水化后的Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，在小室外加含15%胎牛血清1640培養(yǎng)液500 μl，在小室內(nèi)加入200 μl腫瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為5×103，培養(yǎng)液為含2%胎牛血清1640培養(yǎng)液，每組重復(fù)6個樣本。常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉簽小心擦去微孔膜上層細(xì)胞，Hoechst 33258溶液染色。在熒光顯微鏡下計數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)，每個樣本計數(shù)10個視野。

1.7 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的檢測 將各組細(xì)胞分別接種在24孔培養(yǎng)板中，每組6孔，每孔細(xì)胞數(shù)為5×104，常規(guī)培養(yǎng)至形成細(xì)胞單層。在單層培養(yǎng)細(xì)胞上，用直徑1 mm的不銹鋼探針消毒后在底部劃“一”字形橫線，用PBS仔細(xì)沖去細(xì)胞碎片，繼續(xù)培養(yǎng)。鏡下觀察0、24、48、72 h的細(xì)胞運(yùn)動情況。記錄從遷移起點(diǎn)至遷移最遠(yuǎn)端細(xì)胞核之間的距離，每視野取5個不同的位置，用遷移距離反映遷移速度。

2 結(jié)果

2.1 SiRNA載體的構(gòu)建及連接 ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2、ABCE1-SiRNA-N涂布平板后，37℃過夜培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，檢測陽性克隆并電泳，可見構(gòu)建的質(zhì)粒約7 kb大小(圖1)，選取陽性克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果與設(shè)計的序列一致。

圖1 構(gòu)建后SiRNA質(zhì)粒電泳

2.2 轉(zhuǎn)染結(jié)果判定 因構(gòu)建的SiRNA含有DSRed熒光物質(zhì)，轉(zhuǎn)染 ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2、ABCE1-SiRNA-N 后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞胞漿內(nèi)可見紅色的熒光(圖2)，未轉(zhuǎn)染組無熒光表達(dá)，表明成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入NCI-H446細(xì)胞。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后NCI-H446細(xì)胞略腫脹，部分細(xì)胞變圓，死亡;而轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2后細(xì)胞的增殖明顯減慢。

2.3 ABCE1-SiRNA對ABCE1蛋白表達(dá)的影響 Western印跡檢測ABCE1蛋白表達(dá)水平，可見68 KD處一條特異條帶。凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描 ABCE1現(xiàn)色條帶，轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-1和ABCE1-SiRNA-2組與轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-N和空白對照組相比，ABCE1蛋白表達(dá)量明顯下降(圖3)。表明ABCE1-SiRNA-1和ABCE1-SiRNA-2成功轉(zhuǎn)染入小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-1或ABCE1-SiRNA-2能夠抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞ABCE1基因表達(dá)。

圖2 轉(zhuǎn)染SiRNA的NCI-H446細(xì)胞(×100)

圖3 不同組Western印跡結(jié)果

2.4 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力的改變 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后各組NCIH446細(xì)胞略腫脹，轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-N的細(xì)胞增殖改變不明顯，仍然需要2～3 d換液1次。而轉(zhuǎn)染 ABCE1-SiRNA-1或ABCE1-SiRNA-2后細(xì)胞的增殖明顯減慢，需要5～6 d換液1次。根據(jù)OD值，描記各組細(xì)胞生長曲線(圖4)，可見轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-1或ABCE1-SiRNA-2后細(xì)胞的生長明顯滯后于轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-N的細(xì)胞。在鋪板的第3天轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-1的NCI-H446細(xì)胞數(shù)分別是未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-N的65%和63%，轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-2的NCI-H446細(xì)胞數(shù)分別是未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-N的64%和62%(P＜0.05)。在鋪板的第4天轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-1的 NCIH446細(xì)胞數(shù)分別是未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-N的68%和70%，轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-2的NCI-H446細(xì)胞數(shù)分別是未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-N的71%和73%(P＜0.05)。

2.5 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力的檢測 未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-N的NCI-H446細(xì)胞穿膜能力較強(qiáng)，穿膜細(xì)胞數(shù)較多〔分別為(41±5)，(40±4)〕，而轉(zhuǎn)染 ABCE1-SiRNA-1和 ABCE1-SiRNA-2的NCI-H446細(xì)胞穿膜能力較弱，穿膜細(xì)胞數(shù)較少〔分別為(18±4)，(21±5)〕(均P＜0.05)。表明轉(zhuǎn)染 ABCE1-SiRNA后可抑制NCI-H446細(xì)胞的體外侵襲潛能。

2.6 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的檢測 見表1。轉(zhuǎn)染ABCE1-SiR-NA-1和ABCE1-SiRNA-2組，培養(yǎng)24 h后，劃痕無明顯縮小趨勢。轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-1和ABCE1-SiRNA-2組，培養(yǎng)48 h后，劃痕略縮小，但無融合趨勢。空白對照和轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-N組培養(yǎng)48 h后，劃痕明顯開始縮小。轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-1和ABCE1-SiRNA-2組，培養(yǎng)72 h后，劃痕縮小;空白對照和轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-N組培養(yǎng)72 h后劃痕縮小更加明顯且有融合之趨勢。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA后NCI-H446細(xì)胞的遷移能力明顯下降。

圖4 不同組生長曲線圖

表1 各組NCI-H446細(xì)胞不同時刻劃痕的寬度(mm，n=5，s)

表1 各組NCI-H446細(xì)胞不同時刻劃痕的寬度(mm，n=5，s)

與空白對照組比較：1)P＜0.05;與SiRNA-N組比較：2)P＜0.05

0 h 24 h 48 h 72 h空白對照組組別32.18±2.49 27.79±2.17 18.52±1.68 8.34±1.26 SiRNA-N組 31.32±1.76 27.18±1.56 17.42±1.24 8.57±1.91 SiRNA-1組 31.17±1.65 28.51±2.43 23.15±1.881)2)16.58±2.431)2)SiRNA-2組 32.42±1.54 29.59±2.01 24.01±1.661)2)17.23±2.291)2)

3 討論

小細(xì)胞肺癌是一種惡性度極高的腫瘤，早期易發(fā)生淋巴和血行轉(zhuǎn)移。研究表明在小細(xì)胞肺癌的發(fā)生過程中涉及了眾多基因的改變〔3〕。染色體的改變，如 3p、4q、5q、10q、13q 和 17p等染色體的雜合性缺失也常見于小細(xì)胞肺癌患者〔4〕。Eun等〔5〕在4q上發(fā)現(xiàn)了原發(fā)小細(xì)胞肺癌的抑制基因，所有這些缺失部位都可能含有與小細(xì)胞肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。ABCE1基因位于常染色體4q31上，其全長cDNA序列編碼599個氨基酸，編碼的蛋白為67 314 Da。該基因在人體各組織器官普遍表達(dá)〔6〕，但表達(dá)的形式及水平有所不同，并具有組織特異性。其在腦組織、腎臟及前列腺呈高表達(dá)，在肺、肝臟、脾、心臟、胰腺、骨骼肌呈微量表達(dá)，而在脊髓和骨不表達(dá)。ABCE1基因能特異性地與RNase L結(jié)合并抑制其活性，研究顯示ABCE1編碼的RNase L基因的突變與人前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，RNase L的缺失也可能會引發(fā)前列腺癌〔7〕。Chen等〔8〕研究表明應(yīng)用ABCE1基因的SiRNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖能力明顯下降，提示ABCE1基因與該細(xì)胞的增殖有關(guān)。ABCE1抑制的RNase L具有防止病毒擴(kuò)散，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻止細(xì)胞增生失控的作用。細(xì)胞凋亡的抑制是惡性腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔9〕，進(jìn)而可以推測ABCE1基因與惡性腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

RNAi-Ready pSIREN-DNR于832～1 509 bp位置攜帶表達(dá)紅色熒光的蛋白(DsRed)報告基因，在557～579 nm可激發(fā)出紅色熒光，因此轉(zhuǎn)染該載體的細(xì)胞可發(fā)出紅色熒光。通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可直接觀察沉默基因的轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)等。本研究應(yīng)用MTT法研究了ABCE1-SiRNA對轉(zhuǎn)染的小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞株增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ABCE1-SiRNA-1和ABCE1-SiRNA-2均可抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCIH446的增殖。同時證實(shí)ABCE1-SiRNA轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446可抑制其內(nèi)ABCE1的表達(dá)，降低其增殖和遷移能力。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是許多惡性腫瘤治療失敗和患者死亡的主要原因。癌細(xì)胞侵襲是指癌細(xì)胞離開其原發(fā)灶而侵犯了鄰近組織，并在該處繼續(xù)生長繁殖的過程。腫瘤細(xì)胞侵襲破壞細(xì)胞外基質(zhì)并遷移進(jìn)入脈管系統(tǒng)是轉(zhuǎn)移發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)，腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力可反映其惡性程度〔10，11〕。劃痕實(shí)驗(yàn)是測定細(xì)胞遷移能力的一種經(jīng)典研究方法。Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)是一種測定細(xì)胞侵襲能力的方法〔12〕。Transwell小室底部是布滿8 μm直徑小孔的PET膜，可供單個細(xì)胞遷移通過。侵襲實(shí)驗(yàn)則在PET膜上面鋪了一層Matrigel，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，只有具有侵襲能力的細(xì)胞才能通過，細(xì)胞消化了基質(zhì)才能從低營養(yǎng)的培養(yǎng)液進(jìn)入高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里，最后檢測穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量就可以了解細(xì)胞的侵襲能力。本研究證實(shí)ABCE1-SiRNA轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞株后，NCIH446的侵襲及遷移能力均有所下降，因此ABCE1-SiRNA有望為治療小細(xì)胞肺癌提供新的依據(jù)。

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