許官學(xué) 盛 瑾 石 蓓 (貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

CXC族細(xì)胞因子受體4(CXCR4)是目前所知的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)的唯一受體。近年來，SDF-1/CXCR4在缺血性心臟病治療中的作用機(jī)制成為新的研究熱點(diǎn)。然而，在心肌梗死前后，SDF-1/CXCR4在心臟不同部位心肌組織的表達(dá)變化鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過測定急性心肌梗死大鼠心肌SDF-1與CXCR4的表達(dá)水平，探討SDF-1和CXCR4與心肌梗死后心臟功能變化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雄性SD大鼠，體重200～250 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑 L-DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清，Hyclone;Perfect Real Time PCR Kit、SDF-1、CXCR4 上下游引物，TaKaRa;CXCR4(兔IgG)，Abcam;FITC?？寡騍DF-1抗體、SDF-1(山羊IgG)、驢抗兔 CXCR4 抗體，Santa Cruz Biotechnology。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 激光共聚焦顯微鏡，Leica SP2公司;PTPCR分析儀，Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 SD大鼠64只，隨機(jī)分為試驗(yàn)組及假手術(shù)對照組，每組32只。試驗(yàn)組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制作急性心肌梗死模型;對照組僅開胸，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。分別于術(shù)后1、7、14、28 d，每組處死8只取心臟作相關(guān)檢測。若心梗術(shù)中及取材前大鼠死亡，棄去此大鼠，保證每時(shí)間點(diǎn)均為8只。

1.2.2 大鼠心肌梗死模型的建立 SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3～0.35 ml/100 g)麻醉。胸骨左緣第3、4肋間打開胸腔，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，分層縫合關(guān)閉胸腔。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素40萬單位防治感染〔1〕。對照組僅開胸，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

1.2.3 動(dòng)物取材 大鼠常規(guī)頸椎脫臼處死，開胸后分離心臟與胸前壁之間粘連組織，由大血管根部切取下心臟。

1.2.4 心功能的測定 術(shù)后第28天，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后經(jīng)胸壁行超聲心動(dòng)圖檢查。檢測指標(biāo)包括:左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)。所有指標(biāo)均取5個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期測量的平均值。

1.2.5 Real Time(RT)-PCR檢測心肌 SDF-1、CXCR4 mRNA心肌組織無菌生理鹽水沖洗，去除心臟內(nèi)殘余血液后作RTPCR檢測，測定術(shù)前、術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)心肌SDF-1、CXCR4 mRNA的含量。Actb(150 bp)上游引物 5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游引物 5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'。SDF-1(134 bp)上游引物 5'-TGAGAGCCATGTCGCCAGA-3'，下游引物 5'-GGATCCACTTTAATTTCGGGTCAA-3'。CXCR4(149 bp)上游引物 5'-AGCAGGTAGCAGTGACCCTCTGA-3'，下游引物5'-GAAGCAGGGTTCCTTGTTGGAGT-3'。

1.2.6 激光共聚焦檢測 部分心肌組織冰凍切片后作免疫激光共聚焦檢測。共聚焦系統(tǒng)由Bio-Rad公司提供的軟件控制，在IBM計(jì)算機(jī)上運(yùn)行。每組隨機(jī)選取30個(gè)點(diǎn)，掃描細(xì)胞及心肌圖像，分析軟件分析SDF-1/CXCR4在細(xì)胞膜及心肌組織中熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以s表示，組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死模型建立 大鼠左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后心電圖肢導(dǎo)R波振幅顯著升高，胸導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高＞0.1 mV，并持續(xù)0.5 h以上。4 h后檢查心電圖，出現(xiàn)病理性Q波，呈典型的心肌梗死動(dòng)態(tài)改變圖像，提示為心肌梗死，證實(shí)模型成功。

2.2 兩組超聲心動(dòng)圖檢測心功能比較 心肌梗死后28 d，超聲心動(dòng)圖檢測心臟功能結(jié)果見表1，組間比較有顯著性差異(P ＜0.05)。

2.3 兩組心肌SDF-1、CXCR4 mRNA表達(dá)比較 兩組心肌組織均有SDF-1、CXCR4 mRNA表達(dá)。試驗(yàn)組SDF-1、CXCR4 mRNA表達(dá)明顯增加，組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表2，表 3。

表1 心肌梗死后28 d兩組心功能指標(biāo)的比較( s，n=8)

表1 心肌梗死后28 d兩組心功能指標(biāo)的比較( s，n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05;下表同

組別 LVDd(mm)LVDs(mm)EF(%)試驗(yàn)組 28.14±0.391) 20.17±0.531) 33.32±6.881)對照組20.97±0.41 13.01±0.40 51.79±5.11

表2 各組不同時(shí)期SDF-1 mRNA的表達(dá)( s，n=8)

表2 各組不同時(shí)期SDF-1 mRNA的表達(dá)( s，n=8)

1 d 7 d 14 d 28 d試驗(yàn)組44.85±6.251)42.48±11.281)36.38±8.221)33.59±4.611)組別對照組 14.17±2.42 13.80±1.92 13.48±1.56 13.14±1.37

表3 各組不同時(shí)期CXCR4 mRNA的表達(dá)( s，n=8)

1 d 7 d 14 d 28 d試驗(yàn)組25.69±2.781)22.07±1.641)17.73±3.781)17.47±2.921)組別對照組8.03±1.97 7.95±1.84 7.82±1.81 7.68±1.88

表4 各組不同時(shí)期SDF-1蛋白熒光強(qiáng)度的表達(dá)( s，n=8)

表4 各組不同時(shí)期SDF-1蛋白熒光強(qiáng)度的表達(dá)( s，n=8)

1 d 7 d 14 d 28 d試驗(yàn)組10.88±0.041)12.85±0.051)10.46±0.131)9.62±0.061)組別對照組2.14±0.03 2.04±0.05 2.12±0.03 2.11±0.05

2.4 激光共聚焦檢測蛋白表達(dá)變化 兩組心肌組織均有SDF-1和CXCR4蛋白熒光表達(dá)。心肌梗死區(qū)域SDF-1、CXCR4表達(dá)明顯增加，組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表4、表5。免疫激光共聚焦圖片可見SDF-1和CXCR4在梗死心肌及局部血管壁上高表達(dá)。見圖1。

表5 各組不同時(shí)期CXCR4蛋白熒光強(qiáng)度的表達(dá)( s，n=8)

表5 各組不同時(shí)期CXCR4蛋白熒光強(qiáng)度的表達(dá)( s，n=8)

1 d 7 d 14 d 28 d試驗(yàn)組 8.80±0.141)11.48±0.271) 9.25±0.121) 7.55±0.141)對照組2.05±0.05 2.16±0.04 2.13±0.03 1.95±0.06組別

圖1 心肌梗死后7 d組織及血管壁上SDF-1/CXCR4表達(dá)情況(×200)

3 討論

SDF-1也被稱為前B細(xì)胞生長刺激因子(PBSF)，是CXC細(xì)胞因子亞家族成員之一，由Nagasawa等〔2〕于1996年從骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中分離得到。隨后研究發(fā)現(xiàn)SDF-1在不同動(dòng)物機(jī)體中的胸腺、骨髓、肝臟、心臟及大腦等組織中均有廣泛的表達(dá)。CXCR4是目前發(fā)現(xiàn)的SDF-1唯一的并且具有高度特異性的受體。CXCR4同樣表達(dá)于多種組織及器官，如:臍血、骨髓、多種非造血細(xì)胞以及CD34+細(xì)胞表面。

研究發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4表達(dá)變化在組織損傷后修復(fù)過程中扮演著重要作用〔3〕。當(dāng)組織發(fā)生損傷后，損傷部位局部組織細(xì)胞SDF-1的分泌量增加，進(jìn)而誘導(dǎo)外周CXCR4+的各類干細(xì)胞逆SDF-1濃度梯度向受損部位定向遷移，最終參與受損部位組織的修復(fù)和重建。SDF-1還具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞成血管作用，該效應(yīng)可促進(jìn)受損組織部位血運(yùn)重建。研究證明SDF-1是出生后重要的組織修復(fù)因子。同時(shí)，SDF-1是潛在的干細(xì)胞歸巢因子，臨床上可通過調(diào)控SDF-1α的表達(dá)釋放或外源性應(yīng)用達(dá)到治療缺血性損傷的目的〔4〕。在心血管疾病研究中發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4參與了血管新生等作用。本研究發(fā)現(xiàn)正常心肌及心梗后心肌均有SDF-1和CRCX4表達(dá)，而心肌梗死可上調(diào)SDF-1和CRCX4在損傷心肌局部的表達(dá)。

結(jié)合現(xiàn)階段研究報(bào)道〔5，6〕與本研究結(jié)果，我們推測梗死心肌在局部缺血缺氧等損傷環(huán)境條件下SDF-1/CXCR4高表達(dá)，隨著SDF-1分泌入外周血，骨髓及血中CXCR4+干細(xì)胞等具有修復(fù)作用的細(xì)胞逆SPF-1濃度梯度向心梗區(qū)域定向遷徙，當(dāng)?shù)竭_(dá)心梗區(qū)域后與局部組織中高表達(dá)SDF-1和CXCR4的血管壁發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而遷移到受損心肌組織中，促進(jìn)心梗部位組織的修復(fù)及毛細(xì)血管新生〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中SD大鼠急性心肌梗死后，SDF-1和CXCR4在梗死區(qū)心肌組織的表達(dá)隨時(shí)間變化無顯著性差異，可能是因?yàn)樾墓＞植拷M織缺血缺氧，心肌細(xì)胞大量壞死，SDF-1和CXCR4僅能在少量存活組織細(xì)胞上高表達(dá)，從而限制了其在局部組織中的損傷修復(fù)作用。

結(jié)合本研究及目前SDF-1/CXCR4在損傷后修復(fù)中所起作用的研究進(jìn)展，我們有理由相信在將來的研究中可通過調(diào)控心梗局部SDF-1和CXCR4的表達(dá)獲得改善心梗后心臟功能的治療目的。

1 孫敬方.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:369.

2 Nagasawa T，Nakajima T，Tachibana K，et al.Molecular cloning and characterization of a murine pre-B-cell growth-stimulating factor/stromal cellderived factor 1 receptor，a murine homolog of the human immunodeficiency virus 1 entry coreceptor fusin〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1996;93:14726-9.

3 Lee MS，Lill M，Makkar RR.Stem cell transplantation in myocardial infarction〔J〕.Rev Cardiovasc Med，2004;5(1):82-98.

4 Mirshahi F，Pourtau J，Li H，et al.SDF-1 activity on microvascular endothelial cells;consequences on angiogenesis in vitro and in vivo models〔J〕.Thromb Res，2000;99(6):587-94.

5 Askari AT，Unzek S，Popovic ZB，et al.Effect of stromal-cell-derived factor 1 on stem-cell homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy〔J〕.Lancet，2003;362(5):697-703.

6 Lafamma MA，Murry CE.Regenerating the heart〔J〕.Nat Biotechnol，2005;23(7):845-56.

7 Bartunek J，Wijns W，Heyndrickx GR.Timing of intracoronary bone-marrow-derived stem cell transplantation after ST elevation myocardial infarction〔J〕.Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2006;3:S52-S56.