高楊菲，化占勇，沈利明

（江蘇省吳江市農(nóng)業(yè)委員會，江蘇 吳江 215200）

隨著全球經(jīng)濟一體化和食品貿(mào)易國際化發(fā)展，食品安全問題已成為全世界關(guān)注的熱點。近年來，我國的食品安全問題頻發(fā)，對 環(huán)境和人類造成危害，這對食品安全檢測水平和技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。目前應(yīng) 用于食品安全檢測的技術(shù)手段或方法主要有：色譜 法、酶法、免疫法、傳感器法和生物檢測方法等，這些方法都需要對樣品進行前處理，去 除干擾雜質(zhì)； 但在樣品量大，成分復(fù)雜的情況下上述方法不適宜 現(xiàn)場快速檢測，而且存在檢測成本高，檢測重現(xiàn)性 不好等問題。研發(fā)更為快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法已經(jīng)變得迫切需要。在此背景下，許多學(xué)者積極 開發(fā)新的檢測技術(shù)或待檢樣品分離技術(shù)，分子印跡 技術(shù)(molecularly imprinting technology,MIT)應(yīng)運而 生。該技術(shù)是一種新型高效分離及分子識別技術(shù)，由于其具有優(yōu)越的識別性和選擇性，在食品安全檢 測中發(fā)揮著重要的作用。

1 分子印跡技術(shù)

分子印記技術(shù)源于1940年P(guān)auling[1]在免疫學(xué)研 究中提出的抗體形成學(xué)說，即用抗原作為模板來鑄 造對應(yīng)抗體空間結(jié)合位點的結(jié)合理論。到1973年，Wulf等[2]成功發(fā)展了用于色譜手性拆分印記聚合 物。分子印跡的基本原理是[3]：在目標(biāo)底物的存在下，充當(dāng)分子模板的印記分子與功能性單體混合，在一定的溶液中利用交聯(lián)劑與功能性單體聚合，從 而在模板分子周圍占據(jù)著高度交聯(lián)的聚合結(jié)構(gòu)；隨 后印記分子移去，暴露出一個相對于模板分子空間 構(gòu)型相互匹配的具有多重作用點的空穴，此空穴與 印記分子在形狀、大小等方面具有良好的互補性，因而這種聚合物具有特異性識別印記分子的功能。

近幾年發(fā)展起來的分子印記技術(shù)[4]所得到的模 擬生物聚合物(MIPs)與生物識別元件(如酶、抗體、核酸等)相比具有很多優(yōu)點：(1)MIPs的穩(wěn)定性好，能反復(fù)使用50次以上；在室溫干燥環(huán)境中可保存數(shù)年，水中保存4周以上不會影響其性質(zhì)；用酸性、堿 性、金屬離子和其它多種溶液處理時不會降低其識 別特性；能耐受一定的機械強度、高溫及高壓。(2)MIPs具有很高的選擇性，它對印記分子而言是“量身定做”的，而且理論上任何一個分子均可制 備相應(yīng)的MIPs[5]。(3)生物識別元件來自于生物源，在生產(chǎn)過程中往往要使用動物，而分子印記技術(shù)完 全是化學(xué)合成過程。(4)生物分子識別系統(tǒng)不易建立 批量生產(chǎn)工藝，所以價格昂貴，而MIPs則費用低，對于某些小分子化合物如藥物來說，制備其MIPs相 當(dāng)簡單省時，容易建立大規(guī)模生產(chǎn)[6]。

1.1 分子印跡技術(shù)的原理和方法

分子印記技術(shù)的原理：(1)功能單體與目標(biāo)分子的功能基團在適當(dāng)?shù)臈l件下可逆結(jié)合，形 成復(fù)合物；(2)加入交聯(lián)劑，使其與功能單體聚合，形成的聚合 物將目標(biāo)分子包埋在內(nèi)；(3)用一定的物理和化學(xué)方法，將模板分子(即目標(biāo)分子)從聚合物中洗脫，以獲得具有識別功能并與之相匹配的三維空穴。這樣，可以再次選擇性地與模板分子結(jié)合，從而具有專一識別模板分子的功能[7]。過程如圖1所示[8]。

圖1 分子印跡聚合物的制備流程

迄今為止，分子印記技術(shù)主要有兩種：（1）共價鍵法（預(yù)組裝）共價鍵法是由Wulff等人創(chuàng)立 發(fā)展起來的。該方法中印記分子(目標(biāo)分子)和功能 單體以共價鍵的形式結(jié)合生成印記分子的衍生物，該聚合物進一步在化學(xué)條件下打開共價鍵使印記分子脫離。功能單體一般采用小分子化合物。共價鍵 結(jié)合作用包括硼酸酯、西佛堿、縮醛(酮)、酯、螯 合鍵作用等。共價鍵法主要應(yīng)用于制備各種具有特 異識別功能的聚合物，如糖類及其衍生物、甘油酸 及其衍生物、氨基酸及其衍生物、扁桃酸、芳香酮、二醛、三醛、鐵轉(zhuǎn)移蛋白、聯(lián)輔酶及甾醇類物質(zhì)[9]。（2）非共價鍵法（自組織法）非共價鍵法是由Mosbach等[10]發(fā)展起來的。即把適當(dāng)比例的印記分子與功能單體和交聯(lián)劑混合，通過非共價鍵結(jié)合在一起生成非共價鍵印記分子聚合物。這些非共價鍵 包括氫鍵、靜電引力、金屬螯合作用、電荷轉(zhuǎn)移、疏水作用以及范德華力等。此法主要應(yīng)用于下列物 質(zhì)的分離中：染料、二胺、維生素、氨基酸衍生物、多肽、腎上腺素功能藥物阻抑劑、茶堿、二氮雜苯、核苷酸堿基、非甾醇類抗感染藥萊普生和芐胺等。

共價鍵法和非共價鍵法的主要區(qū)別在于單體與 模板分子的結(jié)合機理不同[11](圖2)。

1.2 分子模擬在分子印跡技術(shù)中的應(yīng)用

隨著計算機技術(shù)和量子化學(xué)理論的發(fā)展，分子 模擬的方法已被用于解釋分子印跡聚合物的分子識 別的機理、選擇功能單體、確定模板分子與功能單 體的比例和優(yōu)化分子印跡的體系等。

1.2.1 解釋聚合物識別機理 Wulff[12]利用MolCAD 1.0 分別計算以α-D-甘露吡喃糖苯苷為 模板，4-乙烯基苯硼酸為功能單體的共價型分子印 跡聚合物和以L-苯丙氨基酰替苯胺為模板，α-甲基 苯烯酸為功能單體的非共價型分子印跡聚合物的模 板-功能單體復(fù)合物的靜電勢能面，并 且認(rèn)為靜電勢 能面可以很好地并且直觀地描述分子印跡聚合物中對模板分子具有特異性識別作用的孔穴，且孔穴的大小與模板分子的大小在同一個數(shù)量級。

1.2.2 證實和預(yù)測功能單體與模板分子之間相互作用力Takeuehi等[13]用Monte Carlo構(gòu)象搜索的方法，找到了在以生物素甲酯為模板的預(yù)組裝溶液中 可能存在的模板-功能單體復(fù)合物的構(gòu)象，從 構(gòu)象圖 中可以清楚地看到模板-功能單體之間氫鍵相互作 用的情況。李 萍[14]等 用Hypeehem軟件模擬了以右旋 鄰氯扁桃酸為模板，以丙烯酰胺為功能單體的分子 印跡預(yù)聚合物。2005年Dumitru等[15]用state-of-the-art工具篩選功能單體制備茶堿及其衍生物的分子 印跡聚合物。后 來，D umitru等[16]用模擬的方法發(fā)現(xiàn) 靜電力在分子印跡聚合物聚合過程中扮演重要的角 色。

圖2 分子印跡聚合物共價結(jié)合和非共價結(jié)合的兩種途徑

1.2.3 分子模擬用于功能單體的選擇和功能單體與模板分子比例的確定Piletsky等用分子模擬研究 分子印跡的重點就是功能單體的選擇和功能單體- 模板比例的確定。其核心思想是功能單體與模板之 間具有較強的相互作用，而且功能單體－模板處于合適的計量比時，合成的MIPs具有最高的識別性 能。模板分子與功能單體的相互作用可用以下公式 計算：△E=E（模板-功能單體復(fù)合物）－E（模板）－∑E（功能單體）

在上述指導(dǎo)下，S ergeyeva等[17]先 利用Hypeche于1999年研究了阿特拉津和甲基丙烯酸的復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)模板和功能單體之間可以形成2個離子鍵、2 至3個氫鍵，說明模板和功能單體之間具有較強的相互作用，所 以選擇 MAA作為功能單體是合適的。隨后 Piletsky等[18]使 用SYBYL軟件在SGI工作站 上建立了模板（麻黃素）和20個通常使用的功能單 體的構(gòu)象，這些功能單體就組成了虛擬的功能單體 庫，然后通過 MAX1MIN2 關(guān)鍵字利用分子力場的方法優(yōu)化模板和功能單體的構(gòu)象，并且用Gasteiger-Huckel 方法計算電荷，再 用Leapfrog算法 依次將功能單體與模板分子在各種可能的部位對 接。

1.2.4 分子模擬的研究對印跡體系的優(yōu)化武利慶[19]用分子模擬系統(tǒng)全面地研究了幾種 MIPs 體系，建 立 MIPs 選擇性預(yù)測的理論模型。在此基礎(chǔ)上，他 將所建立的分子模擬方法應(yīng)用到功能單體種類的篩 選、功能單體比例的優(yōu)化以及致孔劑的篩選上。

2 在食品安全檢測領(lǐng)域的應(yīng)用

Chapuis等[20]報 道了以特丁津和莠滅凈為模板 分子，采用低溫紫外引發(fā)制備印跡聚合物，用該聚 合物裝填 3mL 固相萃取柱，能從復(fù)雜基質(zhì)葡萄酒 和土壤中選擇性萃取加標(biāo)莠去津及其代謝物，在10-8級檢測中，能達到基線平穩(wěn)、定量準(zhǔn)確。分離 效果與免疫親和層析柱(immunosorbents IS)相當(dāng)。De Prada等[21]研 究了一種在線 MISPE 過程用來選 擇性富集和伏安法測定牛奶中衡量的磺胺甲基嘧 啶，通過實驗得到的濃縮因子為45。這種方法的檢 測限低于國際食品法典委員會標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(牛奶中磺 胺甲基嘧啶的最大殘留量 25mg/L)，因此可以定量的檢測牛奶中的磺胺甲基嘧啶殘留。Puoci等[22]建 立一個簡單的MISPE，方法從食品中預(yù)富集痕量的蘇丹紅，結(jié)果表明當(dāng)使用HPLC 不能檢測到蘇丹 紅時，M ISPE是一個有效地檢測痕量蘇丹紅的方法。周文輝等[23]采 用以三聚氰胺為模板分子合成了對三聚氰胺具有較好選擇性的分子印跡聚合物。以該分子印跡聚合物為固相萃取材料填充固相萃取小柱，可以從奶粉、純 牛奶等奶制品中選擇性地分離、富集三聚氰胺，并有效地去除奶制品中的復(fù)雜基質(zhì)，取得了良好的效果。對奶粉和液態(tài)奶提取液的加標(biāo) 回收率分別為 91%～103%、93%～98%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏 差(n=3)分別為 719%和111%。該 分子印跡聚合物還有望用于其它奶制品的分析。Maier等[24]用MISPE 方法來檢測紅酒中的致癌物質(zhì)毒汁菌素赭曲霉素，他們發(fā)現(xiàn)非印跡聚合物與 MIPs對模板分子具有相 類似的選擇性，并 且將NIPs 代替 MIPs 作為 SPE的吸附劑來避免模板分子的流出。Z hou等[25]發(fā) 明了一種在線 MISPE2PE 方法，使用熒光檢測器來快速檢 測小麥中的赭曲霉素A，每一個分析過程低于5min。而且，M ISPE2PE 與 LC/MS 聯(lián)用可以對赭曲霉素 A 進行快速的定性和定量分析。

3 展 望

分子印跡技術(shù)經(jīng)過近十多年的發(fā)展，其優(yōu)良的性能 以及對目標(biāo)物的特異性吸附其在手性物質(zhì)分離、仿 生傳感、固相萃取、抗體模擬和催化等領(lǐng)域被得到 了廣泛應(yīng)用。分子印跡技術(shù)憑借其具有的特異結(jié)合 性和較強的耐受能力，回收率高等優(yōu)點，在食品安 全檢測領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。但仍然存在一些問題，如：聚合物的形態(tài)和傳質(zhì)機理還不夠明晰； 功能單體、交聯(lián)劑和聚合方法的選擇使用都有較大的局限性；吸附動力學(xué)過程緩慢；吸附過程機理不 明確、不能廣泛應(yīng)用于水相體系；對大分子物質(zhì)的印跡仍然是一個難題等在某種程度上阻礙了分子印 跡技術(shù)的應(yīng)用。

隨著各種新型材料的不斷涌現(xiàn)，結(jié)合新型材料的分子印跡技術(shù)己成為分子印跡研究的熱點。結(jié)合 新型材料的特性，發(fā)揮不同材料的優(yōu)點以解決分子 印跡技術(shù)存在的問題是今后分子印跡發(fā)展的趨勢之 一。分子印跡方法的不斷改進、新的功能單體不斷 出現(xiàn)、各種新型材料不斷引入都將不斷推動分子印 跡技術(shù)在更高層次上繼續(xù)發(fā)展?？傊?，隨著生物技 術(shù)、電子技術(shù)、合成手段和現(xiàn)代分析檢測手段的迅 猛發(fā)展，分子印跡技術(shù)將日益完善，其必將在食品 安全檢測中發(fā)揮更大的作用。

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