高銀輝 梁海英 王智慧

(河北省樂亭縣醫(yī)院藥劑科，河北 樂亭 063600)

龜象膏是河北省唐山市豐潤區(qū)中醫(yī)醫(yī)院根據(jù)臨床需要研制出的用于治療糖尿病足的制劑[1]，其主要成分為龜版、象皮、白及、黃連、地龍、車前子、升藥、煅石膏等。為考察其安全性，我們參照新藥審批辦法中有關(guān)毒理學(xué)實驗技術(shù)要求及有關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行了該藥的皮膚長期毒性實驗研究，為其臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠154只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半，由河南省實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(豫)2005～0001。每只分籠飼養(yǎng)，基礎(chǔ)飼料為實驗鼠全價顆粒飼料，飲用水為已潔凈消毒的水，籠底墊料為已經(jīng)潔凈消毒的鋸末，每2 d更換1次。實驗室溫度21～24 ℃，濕度55%～70%，光照12 h明暗周期。

1.1.2 實驗儀器 Biofuge strutos型高速低溫離心機(jī)(Kendro Laboratory Products)；JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)；YKH-Ⅰ型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠)；TU-180 紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；FA2104N型普通電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；PTHW型電熱套(鞏義市英峪予華儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械股份有限公司-醫(yī)療器械五廠)；予華SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；CELL-DYN3700全自動五分類血球分析儀(日本光電)；HITACHI7060全自動生化分析儀(日本東芝公司)。

1.1.3 實驗藥物 龜象膏，藥物組成：龜版100 g，象皮粉60 g，白及粉60 g，黃連粉36 g，地龍粉30 g，車前子粉30 g，升藥2 g，煅石膏18 g，芝麻油500 g。制備方法：龜版和芝麻油慢火熬12 h，龜版微枯后，細(xì)絹濾清復(fù)入杓內(nèi)煎滾納入白及粉、黃連粉至白及粉變?yōu)榈S色，微火加入地龍粉及車前子粉，微火熬制，撈除殘渣，濾過，油液備用，煅石膏、升藥采用等量遞增法，將升藥混入煅石膏中，取羊毛脂50 g，加入上述藥油內(nèi)溶化，待溫度降至40～50 ℃時加入象皮粉、升藥及煅石膏的混合粉，再加入凡士林適量備用。實驗對照品為乳膏賦形劑凡士林。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 將154只SD大鼠隨機(jī)分為7組，即空白對照組，完整皮膚高、中、低劑量組及破損皮膚高、中、低劑量組，每組各22只，雌雄各半。

1.2.2 給藥方法 各組大鼠背部脊柱兩側(cè)剃毛，面積約4 cm2，破損皮膚高、中、低劑量組大鼠用針頭在剃毛區(qū)皮膚劃井字，深淺以滲血為度，造成破損皮膚。完整皮膚不予任何處理。完整皮膚、破損皮膚高劑量組在剃毛區(qū)涂龜象膏20 g/(只·d)，中劑量組涂龜象膏10 g/(只·d)，低劑量組涂龜象膏5 g/(只·d)，空白對照組涂乳膏賦形劑凡士林10 g/(只·d)。涂藥后用膠布固定，每日1次，連續(xù)90 d(每周停藥1 d)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般情況 給藥期和恢復(fù)期(停藥14 d)內(nèi)逐日觀察各組大鼠外觀、行為體征、活動、精神狀態(tài)、進(jìn)食、糞便及尿液等情況。每7 d稱體質(zhì)量1次，計算給藥前后體質(zhì)量增減率[體質(zhì)量增減率=(給藥后體質(zhì)量-給藥前體質(zhì)量)/給藥前體質(zhì)量×100%]。如有中毒反應(yīng)，如嘔吐、排泄物異常及皮膚膿腫病變等，則重點觀察，發(fā)現(xiàn)死亡或瀕死者及時尸檢。給藥90 d后，每組取14只大鼠(雌雄各半)用戊巴比妥鈉麻醉后，心臟采血，檢測血常規(guī)及血液生化指標(biāo)，隨后做系統(tǒng)尸檢及病理檢查。各組剩余大鼠在停藥14 d后同法處理。

1.3.2 血液學(xué)指標(biāo) 采用心臟采集動脈血方法，收集血液，檢測各組大鼠血紅蛋白(Hgb)、紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、白細(xì)胞計數(shù)(WBC)及白細(xì)胞分類(包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞)主要血液學(xué)指標(biāo)。

1.3.3 血液生化指標(biāo) 在做血液學(xué)指標(biāo)的同時，收集血液，分離血清，檢測尿素氮(BUN)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及血清總膽紅素(TBiL)主要生化指標(biāo)，并進(jìn)行麝香草酚濁度實驗(TTT)。

1.3.4 系統(tǒng)尸檢及病理檢查 大鼠放血處死后，立即對主要臟器做視觀剖檢，觀察主要臟器及腺體是否有肉眼可見腫大、縮小、色澤及硬度等病變。并取心、肝、脾、肺、腎分別稱質(zhì)量，計算臟器系數(shù)[臟器系數(shù)=(臟器質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量)×100%]。完整皮膚高劑量組、破損皮膚高劑量組及空白對照組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、胸腺、甲狀腺、子宮、卵巢、睪丸、附睪、直腸、十二指腸、胃及皮膚做病理切片檢查。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 給藥期及恢復(fù)期各組大鼠外觀、行為體征、活動、精神狀態(tài)均無明顯異常；飲食、糞便及尿液正常，體質(zhì)量正常增加；無大鼠死亡情況發(fā)生，亦無中毒反應(yīng)。提示龜象膏對正常大鼠及皮膚破損大鼠正常生活無明顯影響。

2.2 各組大鼠主要血液學(xué)指標(biāo)比較 見表1。

表1 各組大鼠主要血液學(xué)指標(biāo)比較 ±s

由表1可見，各組大鼠主要血液學(xué)指標(biāo)之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠主要生化指標(biāo)比較 見表2。

表2 各組大鼠主要生化指標(biāo)比較 ±s

由表2可見，各組大鼠之間AST、ALT、TBiL、TTT及BUN比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組大鼠給藥前后體質(zhì)量增減率比較 見表3。

表3 各組大鼠給藥前后體質(zhì)量增減率比較 ±s

由表3可見，各組大鼠體質(zhì)量增減率之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 各組大鼠主要臟器解剖及病理組織學(xué)檢查 各組大鼠主要臟器心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、腎上腺、甲狀腺、睪丸、子宮等肉眼觀察其位置、形態(tài)、色澤、硬度等均無明顯腫大、縮小、色澤、硬度等異常病變情況。完整皮膚高劑量組、破損皮膚高劑量組及空白對照組動物心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、胸腺、甲狀腺、子宮、卵巢、睪丸、附睪、直腸、十二指腸、胃及皮膚病理檢查結(jié)果均無異常。

2.6 各組大鼠主要臟器系數(shù)比較 見表4。

表4 各組大鼠主要臟器系數(shù)比較 %，±s

由表4可見，各組大鼠主要臟器系數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

糖尿病合并肢端特別是足部壞死性病變稱為糖尿病足(壞疽)，是糖尿病致殘性并發(fā)癥之一。導(dǎo)致糖尿病足的原因有肢端中小血管循環(huán)和周圍神經(jīng)病變，引起局部缺血、缺氧及營養(yǎng)功能障礙，加上局部擠壓、摩擦、碰撞、皮膚干燥破裂，或合并細(xì)菌感染等諸多因素。由于患者對該病缺乏認(rèn)識，治療措施不當(dāng)，病變常在短期內(nèi)加劇，甚者需行截肢或因合并敗血癥而死亡[2]。目前，西醫(yī)綜合治療效果不盡人意。糖尿病足屬中醫(yī)學(xué)消渴、脫疽等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，濕、毒、熱、瘀、虛為其基本病理因素。主要由于寒、濕、毒邪侵淫，氣血凝滯，經(jīng)脈阻滯，或肝腎不足，四肢氣血不充，失于濡養(yǎng)而致足(指)焦黑壞死，甚則脫落。臨床采用中醫(yī)藥療法能取得較好療效，且無明顯不良反應(yīng)[3]。

龜象膏具有潤濕、祛腐生肌、解毒、活血通絡(luò)之效，能對創(chuàng)面深、濕度差、血運差、肉芽生長緩慢的難治性創(chuàng)面起到保濕、促進(jìn)肉芽生長、加速創(chuàng)面愈合的作用，能快速控制炎癥，迅速修復(fù)筋膜，提高保肢率，降低致死率，為糖尿病足的治療提供了一條新思路。龜象膏中龜版滋陰養(yǎng)血；象皮止血斂瘡，收斂護(hù)膚；白及收斂止血，消腫生肌，助龜版潤濕；黃連清熱解毒，與龜版配伍，清內(nèi)外諸火；地龍、車前子有清熱結(jié)、利水道之效；升藥、煅石膏提膿祛腐。諸藥合用，共奏潤濕、化腐生肌、解毒、活血通絡(luò)之效?，F(xiàn)代藥理研究表明，象皮主要成分為蛋白質(zhì)、氨基酸及微量元素，可以促進(jìn)表皮細(xì)胞的增生、分化，使傷口的pH值變化過程加快，促進(jìn)傷口愈合[4]；龜版含角質(zhì)蛋白、脂肪及鈣、磷動物膠，局部應(yīng)用有營養(yǎng)組織細(xì)胞、潤濕作用，促進(jìn)肉芽和組織細(xì)胞生長[5]。

為能安全地在臨床上使用，本實驗測定龜象膏長期連續(xù)經(jīng)皮膚給藥對實驗大鼠的長期毒性，并設(shè)置了完整皮膚和破損皮膚組進(jìn)行實驗。完整皮膚主要用于監(jiān)測藥物對大鼠皮膚刺激的敏感性，破損皮膚主要用于監(jiān)測藥物對大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的治療作用[6]。本實驗依據(jù)長期毒性的實驗時間應(yīng)為臨床療程的2～3倍的原則，最長為3個月[7]，確定本實驗連續(xù)給藥時間為90 d。用龜象膏以高、中、低劑量，分別給予大鼠完整皮膚及破損皮膚，每日1次，連續(xù)90 d。在給藥期及恢復(fù)期內(nèi)大鼠的一般狀況良好，體質(zhì)量增加，主要血液學(xué)指標(biāo)、生化學(xué)指標(biāo)等均屬正常范圍，與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。解剖主要臟器，肉眼未見明顯改變，病理報告未見病理性病變。表明龜象膏長期連續(xù)經(jīng)皮膚給藥對實驗大鼠無毒性反應(yīng)。說明龜象膏在臨床劑量下使用是安全的，可初步推斷適當(dāng)延長治療時間或適當(dāng)加大給藥量亦不會影響其安全性。

[1] 王智慧，趙紅心，谷小芳.龜象膏治療糖尿病肢端壞疽40例療效觀察[J].河北中醫(yī)，2009，31(11)：1623-1624.

[2] 張振濤.中西醫(yī)結(jié)合治療糖尿病肢端壞疽的體會[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2008，6(4)：351.

[3] 鄧秀娟.淺談中醫(yī)藥治療糖尿病肢端壞疽[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13(1)：92.

[4] 李鋆，李秀蘭，張燕玲，等.象皮與擬替代品黃牛皮、水牛皮中蛋白的研究[J].中草藥，2007，38(11)：1656-1658.

[5] 汪祿祥，董寶生，劉家富.藥用龜板的氨基酸和礦質(zhì)元素分析[J].廣東微量元素科學(xué)，2005，12(11)：42-44.

[6] 李太一，申成華，鄭善子，等.藜蘆乳膏的皮膚毒性實驗研究[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報，2004，2(27)：118-120.

[7] 賈春蓉，陳如泉.半硫丸藥物組成毒性實驗研究[J].河北中醫(yī)，2009，31(8)：1225-1226.