王芝瑤，馬玉彬，牟潤芝，孫長江，張東遠(yuǎn)，王永飛

1 暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)系，廣東 廣州 510632

2 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101

3 青島首創(chuàng)瑞海水務(wù)有限公司，山東 青島 266042

4 北京旭陽化工技術(shù)研究院有限公司，北京 100070

微藻由于生物質(zhì)積累速度快，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，含油量高，綜合利用價(jià)值高，被認(rèn)為是最有潛力的生物質(zhì)能源原料之一[1]。微藻用于生產(chǎn)生物燃料的優(yōu)勢明顯，但目前進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還面臨著巨大挑戰(zhàn)，微藻生物燃料生產(chǎn)成本依然較高。生物燃料生產(chǎn)成本中的75%是原料成本[2]。從降低生物原料成本入手成為解決微藻生物燃料生產(chǎn)成本的重中之重。培育生物量積累速率快、油脂產(chǎn)率高的藻種，提供優(yōu)質(zhì)生物燃料原料，是降低微藻生物燃料生產(chǎn)成本的有效手段。

目前培育微藻新品種方法主要包括選擇育種、誘變育種及基因工程育種。相對(duì)而言，誘變育種可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量優(yōu)良突變體，較周期較長的選擇育種優(yōu)勢明顯，誘變會(huì)導(dǎo)致基因組水平突變，這種突變不容易丟失，較基因工程育種也具有一定的優(yōu)勢。近年來，重離子束特別是低能碳、氮離子束作為一種新興的輻射源，由于其對(duì)微生物與植物種子有很強(qiáng)的致突變作用，已經(jīng)在微生物及植物誘變育種研究中取得了巨大的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益[3-4]。目前為止，這種高效的誘變方式尚未應(yīng)用于產(chǎn)油微藻育種。

微擬球藻Nannochloropsis oceanica OZ-1是真核單細(xì)胞綠色微藻，直徑為 2～3 μm，屬于大眼藻綱，單珠藻科，其細(xì)胞內(nèi)總脂含量可達(dá)干重的68%，是公認(rèn)的最有希望用于工業(yè)化的高產(chǎn)油海水藻之一[5-9]。針對(duì)其產(chǎn)油特性育種的研究，目前僅有 1例使用甲基磺酸甲酯 (EMS)誘變提高其產(chǎn)油特性的報(bào)道[10]。本研究以微擬球藻為研究對(duì)象，采用重離子誘變方式進(jìn)行育種，通過大規(guī)模篩選獲得了兩株高生長速率微擬球藻，隨后對(duì)其生物量積累和產(chǎn)油特性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)藻種為美國馬里蘭大學(xué)Chen Feng教授惠贈(zèng)的微擬球藻N. oceanica。培養(yǎng)液為BG-11海水培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為溫度 (25±1)℃，光強(qiáng)為100 μmol/(m2·s)。

1.2 分析方法

1.2.1 重離子誘變與篩選方法

取生長至對(duì)數(shù)生長初期的野生型微擬球藻，測定細(xì)胞數(shù)目，稀釋至 1.5×107個(gè)/mL。分別取藻液1.5 mL，置于無菌平皿中。后在中國科學(xué)院近代物理研究所重離子加速器垂直輻照終端裝置下，用8×107eV/μ的碳離子束進(jìn)行輻照，離子束傳能線密度為31 keV/μm。將劑量范圍設(shè)定為20 Gy、40 Gy、60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy、140 Gy和 160 Gy。通過平板培養(yǎng)與對(duì)照進(jìn)行比較計(jì)算致死率。選取致死率在50%以上輻照條件下的2 000個(gè)藻株進(jìn)行重點(diǎn)篩選。利用Imaging-PAM和酶標(biāo)儀進(jìn)行大規(guī)模篩選，在 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，挑取最大光化學(xué)效率和 OD750值提高 10%以上菌株，最后經(jīng)過50 mL、250 mL錐形瓶和400 mL鼓泡柱式光生物反應(yīng)器反復(fù)驗(yàn)證最終確定誘變株系中生長迅速的兩株突變藻株HP-1和HP-2。

1.2.2 細(xì)胞生長與干重測定

以處于對(duì)數(shù)生長期的突變株和野生株為種子液，接種于400 mL鼓泡柱式光生物反應(yīng)器中，通入2% CO2進(jìn)行培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第0、2、4、6、8、10、12、16、18天取10 mL藻液，使用清洗好的醋酸纖維素膜 (孔徑0.45 μm)抽濾，105 ℃烘至恒重后稱重，測定干重，繪制生長曲線。

1.2.3 產(chǎn)油期生長曲線和總脂含量測定

采用兩步法誘導(dǎo)產(chǎn)油，將處于對(duì)數(shù)生長后期野生型藻株和突變藻株HP-1、HP-2藻液，低速離心后，培養(yǎng)基更換為無氮海水BG11培養(yǎng)基，光照強(qiáng)度提高到300 μmol/(m2·s)，高光缺氮誘導(dǎo)產(chǎn)油。于產(chǎn)油期第0、3、5、7、9天取樣測定產(chǎn)油期生長曲線，同時(shí)取50 mg野生型和突變株凍干藻粉，以氯仿-甲醇共溶劑提取，采用重量法測定總脂含量[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 微擬球藻重離子誘變和篩選方法建立

本研究選取產(chǎn)業(yè)化前景較好的微擬球藻為研究對(duì)象，進(jìn)行重離子誘變育種。不同誘變劑量細(xì)胞致死率結(jié)果 (圖 1)顯示誘變劑量越高其細(xì)胞致死率越高。根據(jù)誘變經(jīng)驗(yàn)，致死率大于50%時(shí)，產(chǎn)生突變的幾率大。致死率為50%的輻照劑量為80 Gy，因此劑量在80 Gy以上輻照條件下的2 000個(gè)藻株作為重點(diǎn)篩選對(duì)象。隨后利用葉綠素?zé)晒鈨x和酶標(biāo)儀進(jìn)行大規(guī)模篩選，進(jìn)一步反復(fù)驗(yàn)證獲得兩株高生長速率微擬球藻突變株 (HP-1和HP-2)。

2.2 突變株生長特性和油脂積累特性

隨后對(duì)篩選獲得的兩株高生長速率突變藻株進(jìn)行生長曲線測定，結(jié)果顯示兩株突變藻株生物量累積較野生型藻株高 (圖2)，培養(yǎng)至第18天時(shí)較野生藻株分別提高18% (HP-1)和26% (HP-2)。

進(jìn)一步對(duì)突變株產(chǎn)油期特性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示突變株HP-1和HP-2產(chǎn)油期生物量積累較野生型藻株大幅提高，在培養(yǎng)末期突變株 HP-1和 HP-2生物量可以分別達(dá)到6.5 g/L和6.6 g/L，野生型藻株為5.6 g/L (圖3A)?？傊客蛔冎旰鸵吧逯昊疽恢?(圖3A)。根據(jù)生物量積累和總脂含量計(jì)算得到各藻株油脂產(chǎn)率，結(jié)果顯示HP-1和HP-2突變株油脂產(chǎn)率較野生型大幅提高，突變株 HP-1和HP-2 可以分別達(dá)到 295 mg/(L·d)和 275 mg/(L·d)，而野生型為247 mg/(L·d)(圖3B)。與已經(jīng)報(bào)道的其他產(chǎn)油微藻油脂產(chǎn)率相比 (表 1)，本研究所獲得的兩株微擬球藻突變株優(yōu)勢明顯。

圖1 微擬球藻重離子誘變各輻照劑量細(xì)胞致死率Fig. 1 Mortality of N. oceanica treated with different dose of heavy-ion irradiation.

圖2 微擬球藻野生型、突變株HP-1和HP-2生長曲線Fig. 2 Growth curve of N. oceanica wild type (WT), HP-1 and HP-2 mutant.

圖3 微擬球藻野生型、突變株HP-1和HP-2產(chǎn)油期生長曲線 (實(shí)心標(biāo)記)、總脂含量 (空心標(biāo)記) (A) 和油脂產(chǎn)率(B)Fig. 3 Growth curve (filled marker), lipid content (empty marker)(A)and lipid productivity (B)of N. oceanica wild type (WT), HP-1 and HP-2 mutant during lipid accumulation phase.

高光缺氮誘導(dǎo)產(chǎn)油時(shí)，油脂大量積累，同時(shí)其生物量也相應(yīng)提高，原因在于細(xì)胞內(nèi)仍殘存已經(jīng)固定的氮源，細(xì)胞仍然可以生長，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞體積增大，最終導(dǎo)致生物量增加[12]。另外發(fā)現(xiàn)未高光缺氮誘導(dǎo)時(shí)細(xì)胞內(nèi)也存在大量油脂，但此時(shí)油脂以極性脂為主，高光缺氮誘導(dǎo)后極性脂大量減少，中性脂大幅增加，最終油脂含量提高。

生物量積累和油脂產(chǎn)率是微藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，本研究所獲得的兩株微擬球藻突變株在生物量積累和油脂產(chǎn)率方面較野生型藻株具有明顯優(yōu)勢，并且在獲得突變株1年后優(yōu)良性狀仍未丟失，但是否可以作為未來產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)藻種，還有待于室外大規(guī)模培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表1 微擬球藻突變藻株HP-1、HP-2和其他已經(jīng)報(bào)道產(chǎn)油微藻油脂產(chǎn)率Table 1 Lipid productivity of N. oceanica HP-1, HP-2 and other microalgae species reported in the literature

3 結(jié)論

本研究以微擬球藻為研究對(duì)象，采用重離子誘變結(jié)合Imaging-PAM和酶標(biāo)儀大規(guī)模篩選獲得兩株高產(chǎn)油突變株 (HP-1和 HP-2)，其主要優(yōu)勢在于生物量積累和油脂產(chǎn)率較野生型藻株高，是否產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢明顯有待于室外大規(guī)模培養(yǎng)驗(yàn)證。

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