王 雁，湯納平，馬 璟

(中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院國(guó)家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203)

據(jù)報(bào)道，肝毒性成為上市藥物被召回的主要原因[1]，在FDA批準(zhǔn)上市的藥物中，80%以上的黑框警告藥物屬于嚴(yán)重肝損傷藥物[2]。目前國(guó)際上認(rèn)可的臨床前安全性評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則中，有關(guān)肝毒性的評(píng)價(jià)主要從臨床生化指標(biāo)如血清轉(zhuǎn)氨酶和總膽汁酸等、組織病理學(xué)和超微病理學(xué)、活性代謝產(chǎn)物及免疫相關(guān)指標(biāo)4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)[3]。然而這些常規(guī)的毒理學(xué)研究終點(diǎn)均因靈敏性、穩(wěn)定性和特異性較差而不能為肝毒性評(píng)價(jià)提供早期準(zhǔn)確的信息。例如，目前肝損傷評(píng)價(jià)的“金標(biāo)準(zhǔn)”丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransaminase，AST)，在檢測(cè)肝損傷過程中有很多局限:①在腎損傷和骨骼肌損傷時(shí)也可檢測(cè)到血清ALT升高[4－6];② 血清ALT水平要達(dá)到對(duì)照組的2～4倍才能被認(rèn)為是肝損傷，臨床上很容易錯(cuò)過肝損傷最佳治療時(shí)期[3，7];③ 出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，如非諾貝特可以誘導(dǎo)血清轉(zhuǎn)氨酶升高但卻無明顯的肝損傷。近幾年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使大規(guī)模篩選靈敏可靠的肝毒性生物標(biāo)志物成為可能[8－11]。然而，迄今為止仍未發(fā)現(xiàn)比ALT和AST更具有優(yōu)越性的生物標(biāo)志物。目前，大量的驗(yàn)證性研究正在進(jìn)行中。

微RNA(microRNA，miRNA)是一類全長(zhǎng)為19～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，由莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄前體加工而成。在進(jìn)化上高度保守[12]，通過與靶mRNA 3'端部分或完全互補(bǔ)，可以抑制靶mRNA翻譯或降解靶mRNA從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。因此在機(jī)體生理和病理過程中起著很重要的作用。隨著miRNA鑒定方法的改進(jìn)，越來越多的miRNA被克隆，并根據(jù)克隆的先后順序在miR后加上阿拉伯?dāng)?shù)字來命名，如 miR－1。研究表明，肝特異性表達(dá)的miR－122參與肝細(xì)胞發(fā)育、表型、分化代謝和應(yīng)激應(yīng)答等過程[13－16]。與傳統(tǒng)的肝毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)相比，循環(huán) miR－122可以有效地區(qū)分肝損傷和肝外損傷[17－18]，且比傳統(tǒng)的蛋白指標(biāo)反應(yīng)靈敏[13，19]，預(yù)測(cè)性較好[17]，與組織病理學(xué)結(jié)果具有很高的相關(guān)性，在個(gè)體之間的反應(yīng)較一致[19－20]。因此，與成分比較復(fù)雜、易變性、易降解的蛋白質(zhì)相比[21－22]，豐富而穩(wěn)定的短鏈循環(huán)miR－122有望成為藥物肝毒性臨床前安全性評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物[23－24]。

理想的生物標(biāo)志物需具備高特異性、靈敏性和非侵襲性等特征(表1)[25]，因此，本綜述將從穩(wěn)定性、特異性和靈敏性3個(gè)方面闡述循環(huán)miR－122作為藥物肝毒性安全評(píng)價(jià)指標(biāo)的潛在優(yōu)勢(shì)。

表1 理想生物標(biāo)志物的特征

1 循環(huán)miR－122的來源及穩(wěn)定性

2008年，Lawrie等[26]首先發(fā)現(xiàn)了循環(huán)血液中 miRNA的存在，這一重大發(fā)現(xiàn)為miRNA作為非侵襲性標(biāo)志物以及應(yīng)用在癌癥疾病的預(yù)防和診斷方面奠定了基礎(chǔ)。隨后，Mitchell等[27]和 Chen 等[24]報(bào)道血漿或血清中存在穩(wěn)定的miRNA。

1.1 循環(huán)miR－122的來源

外周血miR－122在病理狀態(tài)下表達(dá)水平明顯升高，顯示其作為肝損傷特異性生物標(biāo)志物的潛能。但循環(huán)miR－122的來源及與肝組織細(xì)胞中miR－122的關(guān)系尚不清楚。Wang等[13]在小鼠暴露對(duì)乙酰氨基酚24 h后，分別檢測(cè)小鼠肝和血清中 miRNA的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，小鼠肝miR－122的表達(dá)顯著性降低，而血清miR－122的表達(dá)升高最明顯。并推測(cè)，血清中miR－122的升高可能像血清ALT和AST一樣是由壞死和受損細(xì)胞漏出或分泌所致，但這一推斷還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

Chen等[24]發(fā)現(xiàn)，機(jī)體正常狀態(tài)下，循環(huán)miRNA的表達(dá)譜和血細(xì)胞miRNA表達(dá)譜有較高一致性，而病理狀態(tài)循環(huán)miRNA表達(dá)譜和正常機(jī)體血細(xì)胞miRNA表達(dá)譜相關(guān)性很低，與損傷機(jī)體血細(xì)胞miRNA的差異也增大。這說明在正常狀態(tài)下，血清miRNA主要是由血細(xì)胞分泌而來，而在組織病變時(shí)，血清 miRNA主要來自受損的組織細(xì)胞。關(guān)于miRNA如何從組織細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)中，主要有2種推測(cè)[28－30]:① 被動(dòng)漏出;② 主動(dòng)分泌。目前已有一些研究證實(shí)了miRNA的主動(dòng)分泌[31－33]。這些也都為循環(huán) miR－122的來源提供了線索。McDonald等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在游離血紅蛋白濃度達(dá)到12.0 g·L－1時(shí)，溶血現(xiàn)象對(duì)循環(huán) miR－122的表達(dá)無任何影響，這與正常狀態(tài)下血循環(huán)中miRNA來源于血細(xì)胞有悖。因此，循環(huán)miR－122的來源及其與肝組織細(xì)胞miR－122的關(guān)系仍需要深入研究。

1.2 循環(huán)miR－122的穩(wěn)定性

研究表明，循環(huán)miRNA在外周血中可以高度穩(wěn)定地存在[24，27]。Chen 等[24]通過研究不同條件(高溫煮沸、低/高pH、長(zhǎng)期儲(chǔ)存和反復(fù)凍融等)處理后的血漿miRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，這些處理?xiàng)l件下的miRNA與未處理的血漿中miRNA表達(dá)水平并無明顯差異。為了證明miRNA可以抵制血漿RNA酶的降解，在消化和未經(jīng)消化處理的RNA酶A血漿樣品中，通過RT－PCR分析表明，RNA酶A對(duì)血漿中miRNA并沒有產(chǎn)生影響，3 h之內(nèi)仍保持完整結(jié)構(gòu)。因此，相對(duì)于成分比較復(fù)雜、易變性和易降解的代謝物，循環(huán)miRNA更適宜作為生物標(biāo)志物。

目前，關(guān)于體液miRNA能夠穩(wěn)定存在的原因仍在研究中。研究顯示，循環(huán)中miRNA被細(xì)胞分泌的胞外體或微泡等包裹，并且由它們的膜性結(jié)構(gòu)保護(hù)[35－36]。Turchinovich 等[37]在研究胞外miRNA特征時(shí)，證明miRNA之所以在細(xì)胞外能長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，主要是因?yàn)樾纬闪艘环NmiRNA/Ago2復(fù)合體，而該復(fù)合體可以有效地抵抗核酸酶/蛋白酶。關(guān)于循環(huán)miR－122穩(wěn)定的確切分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

2 循環(huán)miR－122生物標(biāo)志物的肝特異性

2.1 肝組織的高表達(dá)

Lagos－Quintana 等[38]通過克隆成年小鼠特定組織的miRNA以確定miRNA在不同組織分布的實(shí)驗(yàn)中證明，miR－122占所有肝克隆的miRNA的72%，并且在其他組織中未檢測(cè)到miR－122的表達(dá)。Chang 等[39]進(jìn)一步使用 RT－PCR 檢測(cè)miR－122在成年大鼠的不同組織的表達(dá)水平，其中在成年大鼠肝中，每個(gè)肝細(xì)胞的miR－122的表達(dá)水平高達(dá)50000拷貝。而在肺、脾、心臟和骨骼肌的表達(dá)幾乎檢測(cè)不到。

Baskerville等[40]利用微陣列芯片表達(dá)譜技術(shù)研究了175種miRNA在人類24個(gè)組織器官中的表達(dá)，通過對(duì)175種miRNA表達(dá)譜的層級(jí)聚類分析得到各種miRNA在不同組織的表達(dá)特異性，其中miR－122在肝中相對(duì)表達(dá)量為1000，而在其他組織相對(duì)表達(dá)量均≤10。

Kim等[41]通過挖掘有關(guān)研究miRNA表達(dá)譜的文獻(xiàn)，并對(duì)每個(gè)相對(duì)獨(dú)立的表達(dá)譜進(jìn)行相關(guān)性分析和SOM算法聚類分析，結(jié)果表明，miR－122在肝中表達(dá)信號(hào)最強(qiáng)而在其他組織表達(dá)信號(hào)很低甚至無信號(hào)。

上述關(guān)于miRNA的表達(dá)分析表明，miR－122在肝中高度表達(dá)，在其他組織表達(dá)很低甚至檢測(cè)不到，其表達(dá)量占肝中所有miRNA的70% 以上。因此，通過檢測(cè)外周血中miR－122的變化，就可以預(yù)測(cè)藥物對(duì)肝是否有損傷作用，從而也可以預(yù)測(cè)新藥的毒性作用靶點(diǎn)。

2.2 與肝損傷的相關(guān)性

Starkey Lewis 等[17]研究了循環(huán) miR－122 與對(duì)乙酰氨基酚急性中毒的關(guān)系，并進(jìn)一步檢測(cè)了外周血中腦組織高度表達(dá)的miR－128、肝組織高度表達(dá)的miR－129和心臟富集的miR－1的變化。與對(duì)照組相比，肝組織高表達(dá)的miR－122有顯著性升高，血清miR－218無明顯改變。通過Pearson相關(guān)性分析，對(duì)乙酰氨基酚急性中毒組血清miR－122表達(dá)水平與血清ALT活性有較好的相關(guān)性，血清miR－129和miR－1與血清ALT活性的相關(guān)性均很差。同時(shí)在慢性腎損傷模型中，外周血miR－122也只有輕微的變化，且血清miR－122在對(duì)乙酰氨基酚中毒患者和慢性腎損傷患者外周血中的表達(dá)水平有顯著性差異。進(jìn)一步監(jiān)測(cè)肝移植后的對(duì)乙酰氨基酚急性中毒患者血清miR－122的表達(dá)水平與ALT活性的改變，發(fā)現(xiàn)血清miR－122表達(dá)早于ALT達(dá)到正常的基線水平。

Zhang等[18]通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)慢性乙肝患者外周血miR－122表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)miR－122顯著升高，且與肝組織病理學(xué)變化程度和血清ALT峰值有很好的相關(guān)性。為了進(jìn)一步證明miR－122作為肝損傷生物標(biāo)志物的特異性，又比較了健康個(gè)體和僅肌肉損傷患者血漿miR－122差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌肉損傷導(dǎo)致血清ALT活性升高7.8倍，而肌肉損傷患者外周血miR－122較正常組無顯著性變化。

由此可知，miR－122的表達(dá)水平與肝損傷程度密切相關(guān)，在藥物誘導(dǎo)的肝損傷模型中，miR－122發(fā)生特征性的改變，呈劑量依賴性且較傳統(tǒng)的肝損傷標(biāo)志物血清轉(zhuǎn)氨酶特異性高。

3 循環(huán)miR－122生物標(biāo)志物的靈敏性

目前，雖然尚不清楚miR－122在肝損傷病理過程中如何發(fā)揮作用，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，循環(huán)miR－122在肝損傷早期就可以檢測(cè)到有顯著性升高，較傳統(tǒng)的肝毒性生物標(biāo)志物靈敏。

Wang等[13]在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷模型中發(fā)現(xiàn)，給藥后24 h，血漿中有44種miRNA的表達(dá)水平是對(duì)照組的2倍以上，其中25種顯著升高，而miR－122變化最顯著。為了檢測(cè)miR－122的靈敏性，他們?cè)诮o予對(duì)乙酰氨基酚不同劑量后1和3 h檢測(cè)血漿miR－122和ALT的變化，兩者都呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性，但對(duì)乙酰氨基酚過量暴露引起miR－122的變化更加明顯，而且在亞毒性劑量給藥后3 h和中毒劑量給藥后1 h，就可以檢測(cè)到血漿中miR－122的升高，血清轉(zhuǎn)氨酶卻無明顯變化。Laterza等[20]研究了CCl4和CBrCl3誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型中肝特異性miR－122在外周血中的變化。結(jié)果顯示，在組織病理學(xué)觀察到明顯的肝細(xì)胞凋亡和壞死時(shí)，與對(duì)照組相比，血漿miR－122升高的倍數(shù)較ALT升高倍數(shù)明顯。另外，在分析肝損傷模型組單個(gè)動(dòng)物血漿miR－122和ALT變化與組織病理學(xué)結(jié)果相關(guān)性時(shí)，每只動(dòng)物血漿miR－122的升高與肝細(xì)胞凋亡、壞死具有一致性，而血清ALT個(gè)體之間變化比較大，有些動(dòng)物血清ALT只有輕微升高或明顯升高，而有些動(dòng)物甚至檢測(cè)不到血清ALT的變化。

Yamaura等[19]在研究對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)SD大鼠肝損傷模型中，同樣證實(shí)了 miR－122在給藥后3 h開始升高，12 h達(dá)到峰值，而血清ALT在給藥后6 h開始升高，24 h達(dá)到峰值。在比較動(dòng)物個(gè)體之間的差異時(shí)，miR－122的變異系數(shù)為8.21%，ALT的變異系數(shù)為 80.7%。因此，循環(huán)miR－122在動(dòng)物個(gè)體之間的反應(yīng)較血清ALT一致。

上述研究成果提示，外周血miR－122作為肝損傷潛在生物標(biāo)志物較傳統(tǒng)的肝損傷評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)血清轉(zhuǎn)氨酶更加靈敏，而且在動(dòng)物個(gè)體之間的變化比較一致。

4 展望

循環(huán)miR－122因其在肝組織表達(dá)的特異、穩(wěn)定和靈敏而有望成為肝毒性新的可靠的生物標(biāo)志物。比起標(biāo)準(zhǔn)的ALT/AST測(cè)試，循環(huán)miR－122可以為早期肝損傷提供靈敏和特異性的指標(biāo)。又因?yàn)閙iR－122在進(jìn)化上的高度保守且已在臨床試驗(yàn)中檢測(cè)到，因此，其在臨床前診斷結(jié)果可以為臨床試驗(yàn)提供參考，而且循環(huán)miR－122生物標(biāo)志物更易推向臨床實(shí)踐。

根據(jù)FDA和ICH分別頒布的關(guān)于新的生物標(biāo)志物認(rèn)證指導(dǎo)方案[42－43]，一個(gè)新的生物標(biāo)志物的認(rèn)證需要大量的研究數(shù)據(jù)支持。循環(huán)miR－122是否能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)的肝毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)或者作為肝毒性評(píng)價(jià)的補(bǔ)充指標(biāo)，尚需要更多更深入的研究來證明，比如必須明確循環(huán)miR－122表達(dá)與特定的藥物、具體的肝損傷機(jī)制或整體肝損傷的相關(guān)性，及其對(duì)肝損傷的預(yù)測(cè)及預(yù)后價(jià)值。更重要的是，需要闡明肝正常狀態(tài)下和被損傷時(shí)，循環(huán) miR－122的來源和它與肝組織細(xì)胞miR－122的關(guān)系，從而為循環(huán)miR－122作為肝損傷藥物安全評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物提供更充分的證據(jù)。另外，血清轉(zhuǎn)氨酶之所以能成為目前肝損傷的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)指標(biāo)，還在于其臨床上快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。因此，研發(fā)循環(huán)miR－122更為精確、可行、方便和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法顯得很有必要。

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