楊 嶸，張立實(shí)，王以美，張 麗，黃麗娜，張廷芬，束玉磊，趙 君，彭雙清

(四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院1.毒理學(xué)教研室，3.營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，四川成都 610041;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評價研究中心，北京 100071)

性早熟是指女性兒童8歲前，男性兒童9歲前開始的第二性征發(fā)育。近年，全球兒童的性早熟發(fā)生率顯著增加，其對患兒身心健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響[1]。性早熟按其性質(zhì)可分為真性性早熟和假性性早熟兩種類型[2]。真性性早熟是由于下丘腦-垂體-性 腺 軸 (hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)被提前激活而導(dǎo)致生殖能力的提前出現(xiàn)[3];假性性早熟是指HPGA并沒有提前啟動，僅表現(xiàn)為部分第二性征的提前出現(xiàn)。目前報道的真性性早熟模型的建立，主要有由達(dá)那唑[4]和N-甲基-DL-天冬氨酸[5]誘導(dǎo)的兩種，雌激素誘導(dǎo)真性性早熟的發(fā)生罕見報道。大鼠青春期發(fā)育過程與人類近似[6]，且大鼠性發(fā)育各項(xiàng)指征明確，性早熟建模時間短(2～3個月)，性周期短(4～5 d)，因此本次研究選擇大鼠作為性早熟研究的實(shí)驗(yàn)動物。連續(xù)5 d給予青春期前雌性大鼠 17β-雌二醇50 μg·kg－1，觀察大鼠性發(fā)育過程中HPGA功能的改變，探討雌二醇誘導(dǎo)真性性早熟模型建立的意義，及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CR3i型低溫高速冷凍離心機(jī)和MK3型多功能酶標(biāo)儀(上海Thermo公司);BT224S型電子天平(德國Sartorius公司);CKX41型倒置顯微鏡和全自動高壓滅菌器(日本Sanyo公司);TC-412型PCR儀(美國 ABI)。17β-雌二醇，購自美國Cayman公司;大鼠黃體生成素(luteinizing hormone，LH)，卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)，雌激素(estradiol，E2)ELISA 檢測試劑盒，購自美國Rapidbio.Lab公司;PCR轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自美國Fermentas公司;促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)、Kiss-1、G蛋白偶聯(lián)受體54(G protein-coupled receptor-54，GPR54)引物由Invitrogen公司合成(表1)。

參照文獻(xiàn)[7]并經(jīng)過一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定雌二醇的濃度為 50 μg·kg－1，生理鹽水為溶劑。

1.2 動物

SPF級Sprague-Dawley(SD)未孕大鼠，雌、雄鼠各15只，體質(zhì)量250～300 g(♀)，300～350 g(♂)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK-(軍)2007-004。恒溫(22～26℃)、恒濕(40%～70%)，自由攝食飲水。

Tab.1 Primers used in reversed transcriptase PCR

1.3 交配及動物分組給藥

大鼠1∶1合籠交配，自由飲食。孕鼠單籠飼養(yǎng)，生產(chǎn)后，選用雌性仔鼠，由親母自養(yǎng)。雌仔鼠在出生后(postnatal day)15日齡(PND15)時予以標(biāo)記編號，隨機(jī)分為溶劑對照組和雌二醇模型組。每組20只，溶劑對照組ig給予生理鹽水，模型組ig給予雌二醇溶液 50 μg·kg－1(2.5 ml·kg－1)，每天 1 次，連續(xù)5 d。仔鼠在PND21時斷奶。

1.4 觀察大鼠陰門開啟時間并測定大鼠第一個發(fā)情間期及性周期穩(wěn)定后第一個發(fā)情期出現(xiàn)的時間

給藥結(jié)束后，隨機(jī)選擇溶劑對照組及模型組幼鼠各10只。每日觀察幼鼠的陰門開啟(vaginal opening，VO)情況，上、下午各檢查一次。陰門開啟后，陰道涂片法檢查[8]大鼠第一個發(fā)情間期(first diestrus，D1)和性周期穩(wěn)定后第一個發(fā)情期出現(xiàn)的時間(first estrus in regular estrous cycle，E1)。陰道涂片法即用生理鹽水浸濕的棉簽輕擦大鼠陰道，取出后于載玻片上涂片，片子自然風(fēng)干后，HE染色，低倍光鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)以確定大鼠性周期各個階段，每日8:00定時檢測。

1.5 ELISA法測定血清中性激素水平

溶液對照組和模型組另外10只幼鼠，幼鼠陰門開啟后定時做陰道涂片。模型組大鼠陰門開啟當(dāng)天(第一時間點(diǎn))及出現(xiàn)第一個發(fā)情間期當(dāng)天(第二時間點(diǎn))眼眶靜脈叢采血約1 ml，溶劑組大鼠同時1∶1采血，血漿室溫靜置 10 min，3500 ×g 離心15 min，取上清－80℃保存。ELISA法測定上述兩個時間點(diǎn)雌性大鼠血清中LH，F(xiàn)SH，E2的水平。

1.6 性器官病理學(xué)檢查及逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測下丘腦GnRH，Kiss-1，GPR54和垂體GnRH受體基因表達(dá)水平檢測

同1.5步驟中所用幼鼠。模型組大鼠在出現(xiàn)第一個發(fā)情間期的當(dāng)天下午4點(diǎn)頸椎脫臼處死，等數(shù)量處死溶劑對照組大鼠。取子宮、卵巢、陰道，稱質(zhì)量，計(jì)算子宮、卵巢和陰道系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。取下丘腦、垂體，逆轉(zhuǎn)錄PCR法測定下丘腦GnRH，Kiss-1，GPR54 mRNA和垂體GnRH受體mRNA的表達(dá)。擴(kuò)增片段分別為105，350，104，122和550 bp片段。提取下丘腦、垂體總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA后，PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系總體積25 μl，條件設(shè)置為:94℃預(yù)變性1 min;94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共40個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，紫外凝膠圖像分析系統(tǒng)攝片并對拍攝的照片進(jìn)行密度掃描，以目的基因條帶積分吸光度值(integrated absorbance，IA)對內(nèi)參基因β肌動蛋白積分吸光度的比值表示目的基因的相對表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察

在整個實(shí)驗(yàn)過程中，溶劑對照和模型組大鼠均無死亡，且生長狀況良好，進(jìn)食及飲水均未見異常。與溶劑對照組大鼠比較，PND 15，PND 19和PND 35時，模型組體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

Tab.2 Effect of prepubertal exposure to 17β-estradiol(E2)on body mass of female SD rats

2.2 雌二醇對雌性大鼠VO，D1和E1的影響

如表3所示，與溶劑對照組比較，模型組大鼠VO，D1和E1出現(xiàn)的平均日齡著提前，分別提前了14.6 d，14.5 d 和11.3 d 左右(P＜0.05)。提示雌二醇可誘導(dǎo)雌性大鼠的青春期啟動顯著提前。

2.3 雌二醇對SD大鼠動情周期中各階段陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)的影響

陰道涂片結(jié)果顯示，模型組大鼠脫落上皮細(xì)胞的周期性變化和溶劑組大鼠一樣，出現(xiàn)規(guī)則的4～5 d四期性周期表現(xiàn)，順序依次為發(fā)情期、發(fā)情后期、發(fā)情間期、發(fā)情前期，且兩組大鼠動情周期中各階段的陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)相同:發(fā)情期陰道涂片以無核的角化上皮細(xì)胞為主，一般無白細(xì)胞(圖1A1，B1);發(fā)情后期陰道涂片可見白細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞和角化上皮細(xì)胞，且三者比例相當(dāng)(圖1A2，B2);發(fā)情間期陰道涂片以白細(xì)胞為主，細(xì)胞量較多(圖1A3，B3);發(fā)情前期陰道涂片可見大量有核上皮細(xì)胞和少量的角化上皮細(xì)胞，細(xì)胞量較多(圖1A4，B4)。

Tab.3 Effect of prepubertal exposure to E2on VO，D1 and E1 in SD rats

2.4 雌二醇對雌性大鼠子宮、卵巢和陰道指數(shù)的影響

如表4所示，與溶劑對照組比較，模型組大鼠陰道指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而子宮和卵巢指數(shù)無顯著差異。

Tab.4 Effect of prepubertal exposure to E2on organ index in female rats

2.5 雌二醇對大鼠不同時間段血清LH，F(xiàn)SH和E2的變化

如表5所示，與溶劑對照組相比，模型組大鼠陰門開啟當(dāng)天(第一時間點(diǎn))血清LH和FSH的含量分別顯著增加了144%與139%(P＜0.01);血清E2含量亦有增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。溶劑對照組和模型組大鼠 FSH/LH值均＞1，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

與溶劑對照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)第一個發(fā)情間期當(dāng)天(第二時間點(diǎn))血清LH，F(xiàn)SH和E2含量分別顯著增加了176%，124%和207%(P＜0.05);模型組大鼠FSH/LH值＜1，與溶劑對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

Fig.1 Effect of E2on vaginal epithelium during estrous cycle stages of female SD rats(HE ×100).A:control group(A1，estrus;A2，metestrus;A3，diestrus;A4，proestrus);B:model group(B1，estrus;B2，metestrus;B3，diestrus;B4，proestrus).

Tab.5 Effects of prepubertal exposure to E2on serum LH，F(xiàn)SH and E2levels in female SD rats

2.6 雌二醇對大鼠下丘腦GnRH，Kiss-1，GPR54與垂體GnRH受體mRNA表達(dá)水平的影響

逆轉(zhuǎn)錄PCR(圖2A)及其定量結(jié)果(圖2B)顯示，與溶劑對照組相比，模型組大鼠下丘腦GnRH、Kiss-1、GPR54和垂體GnRH受體mRNA表達(dá)均明顯增多(P＜0.01);GnRH，Kiss-1，GPR54和GnRH受體mRNA相對表達(dá)水平分別增加了155%，130%，900%和175%(P＜0.01)。

Fig.2 Effects of E2on mRNA expressions of GnRH，Kiss-1，GPR54 and GnRHR in female SD rats by reverse transcriptase PCR.See Tab.2 for rats treatment.B:quantitative analysis results of A.Lane 1:vehicle control;lane 2:model.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with control group.

3 討論

陰門開啟和第一次排卵的發(fā)生是判斷雌性大鼠青春期啟動的兩個決定性標(biāo)準(zhǔn)，第一次排卵發(fā)生的間接指征為第一個發(fā)情間期的出現(xiàn)[6];而第一個規(guī)則性周期的出現(xiàn)是判斷女性青春期發(fā)育完成的終點(diǎn)[9]，本次研究中采用E1代替第一個規(guī)則性周期的出現(xiàn)，提示模型組大鼠的青春期啟動提前。溶劑對照組和模型組大鼠動情周期中各階段陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)相同，動情周期的持續(xù)時間基本相同，說明給予雌二醇后，大鼠的動情周期表現(xiàn)與正常進(jìn)入青春期組的大鼠相同。而模型組大鼠陰道指數(shù)相對升高，提示雌二醇可誘導(dǎo)大鼠第二性征提前出現(xiàn)。

臨床上對于兒童性成熟診療的基本步驟，首先是確定性激素活性是否增加[10]，而激素檢測的基礎(chǔ)內(nèi)容主要是FSH，LH和E2值。若FSH/LH＞1，提示處于青春期前，反之則說明進(jìn)入青春期[11－12]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠LH，F(xiàn)SH和E2水平較溶劑對照組顯著提高，同時還觀察到溶劑對照組在血清性激素檢測的兩個時間點(diǎn)FSH/LH均＞1，提示溶劑對照組大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時尚處于青春期前;而模型組大鼠在第二個時間點(diǎn)FSH/LH＜1，提示在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，模型組大鼠已出現(xiàn)真性性早熟。

激活GnRH釋放是促進(jìn)青春期啟動的關(guān)鍵，近年研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦GPR54與其配體kisspeptins(kiss-1基因編碼產(chǎn)物)對GnRH釋放的激活起關(guān)鍵作用[13]。研究顯示，雄性猴發(fā)育期間Kiss-1和GPR54 mRNA 含量增加[14]，且 Kiss-1 和 GPR54基因敲除小鼠很難正常啟動性發(fā)育[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組下丘腦GnRH和垂體GnRH受體基因的表達(dá)水平明顯增多，提示雌二醇可誘導(dǎo)下丘腦GnRH和垂體GnRH受體mRNA合成增加;且模型組大鼠Kiss-1及GPR54 mRNA表達(dá)水平顯著增加，說明Kisspeptins/GPR54系統(tǒng)的激活在雌二醇誘導(dǎo)真性性早熟中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)的作用。

綜上所述，雌二醇可通過上調(diào)幼齡雌性大鼠下丘腦Kiss-1基因的表達(dá)，誘導(dǎo)GnRH的合成和分泌，從而使雌性大鼠HPGA功能提前啟動，建立了良好的真性性早熟模型。

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