于曉明，張麗華，張玉奎

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，江蘇南京 210009;2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所高效分離與表征實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116021)

氨甲喋呤(methotrexate，MTX)是一種葉酸拮抗劑，最初被用于惡性腫瘤治療[1]，目前臨床上常用于急性白血病、尤其是急性淋巴細(xì)胞性白血病的維持治療[2－4]，對(duì)頭頸部腫瘤、乳腺癌、肺癌及盆腔腫瘤也有一定療效。MTX也可以作為抗炎和免疫抑制劑用于其他非腫瘤疾病的治療。MTX于20世紀(jì)50年代作為“改變病情抗類風(fēng)濕藥物”(disease modifying antirheumatic drug，DMARD)被用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療，目前是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的一線藥物。但有1/3類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者對(duì)氨甲喋呤治療不敏感，而且骨髓抑制、肝細(xì)胞毒性等毒性作用在一定程度限制了其應(yīng)用[5－7]。MTX也是治療中度至重度銀屑病的一線藥物，但同樣存在患者間反應(yīng)性的差異和急性骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)及肝細(xì)胞毒性等作用[8－9]。作為抗炎和免疫抑制劑，MTX也被用于潰瘍性結(jié)腸炎、以及多肌炎、皮肌炎、多發(fā)性肉芽腫等自身免疫性疾病的治療和急性移植物抗宿主疾病的預(yù)防性治療[10－11]。MTX治療效果明顯，但對(duì)其作用機(jī)制仍不清楚。因此，研究MTX細(xì)胞內(nèi)作用靶點(diǎn)對(duì)于闡明其作用機(jī)制和毒性以及毒理具有重要意義，可以幫助增加有效性，減少毒性，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。

化學(xué)蛋白組學(xué)是利用化合物標(biāo)記或富集細(xì)胞或組織內(nèi)與化合物有親和作用的蛋白質(zhì)組，再利用質(zhì)譜對(duì)被標(biāo)記或富集的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定?；谟H和色譜的化學(xué)蛋白組學(xué)方法是通過固載小分子化合物的親和色譜法純化與化合物特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，再通過質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析和鑒定，其過程是將化合物通過間隔臂固載于固相載體表面，再利用此基質(zhì)親和富集細(xì)胞裂解液或組織勻漿液中相互作用的蛋白，對(duì)得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)分離和質(zhì)譜分析鑒定[12]。上述化學(xué)蛋白組學(xué)方法已用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白激酶抑制劑的細(xì)胞內(nèi)蛋白靶點(diǎn)分析和cAMP，cGMP及磷脂酰肌醇等第二信使分子的下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究[13－15]。本文利用化學(xué)蛋白組學(xué)的原理和方法，以鍵合MTX的瓊脂糖凝膠為親和材料，富集小鼠肝組織內(nèi)與其相互作用的蛋白，利用質(zhì)譜對(duì)富集的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析和鑒定，研究MTX細(xì)胞內(nèi)相互作用蛋白靶點(diǎn)，從而為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和毒理提供實(shí)驗(yàn)線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

MTX－瓊脂糖凝膠、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfongl fluoride，PMSF)、胰蛋白酶、尿素、二硫蘇糖醇、碘乙酸均購(gòu)自于Sigma公司，其余試劑均為分析純或色譜純。

1.2 儀器

FS－2型高速勻漿器購(gòu)自北京科思佳公司，離心超濾管購(gòu)自于Millipore，LC－20AD高效液相色譜儀為SHIMADZU產(chǎn)品，LCQ離子阱質(zhì)譜儀為Thermo公司出品，反相液相色譜C18微柱(5 μm，200 A，直徑300 μm×50 mm)購(gòu)自于依利特公司。

1.3 小鼠肝組織勻漿液樣品制備

取小鼠肝 3 g，剪碎，以 PBS 100 mmol·L－1(pH 7.4)清洗3次去除組織含有的血液成分，加3 ml PBS(含有 PMSF 1 mmol·L－1)勻漿液，勻漿5 min，12000×g離心30 min，取上清備用。

1.4 勻漿樣品與氨甲蝶呤－瓊脂糖凝膠相互作用分析

取0.1 ml鍵合MTX的瓊脂糖凝膠分別裝入2 個(gè)離心管內(nèi)，以 PBS 100 mmol·L－1(pH 7.4)進(jìn)行清洗。取500 μl肝組織勻漿液加入離心管內(nèi)，與凝膠于室溫反應(yīng)1 h，以1 ml 0.1%PBST(PBS中含有0.1%吐溫－20)清洗凝膠去除凝膠表面非特異吸附蛋白，共洗滌10次。收集最后一次洗脫液(PBST洗脫液)進(jìn)行SDS－PAGE分析。以 NaCl 1 mol·L－1洗脫結(jié)合于 MTX－瓊脂糖凝膠表面的蛋白，收集樣品進(jìn)行SDS－PAGE分析。

1.5 SDS－PAGE檢測(cè)洗脫樣品蛋白

對(duì)PBST洗脫液，NaCl 1 mol·L－1洗脫液中的蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE分析，采用銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行染色處理。

1.6 樣品除鹽

將親和富集的蛋白樣品溶液裝入截留分子量3000 u的超濾離心管，以 12000×g超濾濃縮15 min至溶液體積為 0.2 ml，再加入 1 ml Tris－HCl 0.15 mo·lL－1(pH 8.4)，以上述條件超濾濃縮至0.2 ml，如此重復(fù)超濾濃縮3次進(jìn)行溶液置換。

1.7 蛋白酶解

將洗脫的蛋白樣品溶解于終濃度8 mol·L－1尿素中，加入二硫蘇糖醇進(jìn)行還原，56℃反應(yīng)40 min，再加入碘乙酸，室溫反應(yīng) 40 min。以 Tris－HCl(pH 8.5)50 mmol·L－1稀釋至尿素濃度為2 mol·L－1后加胰蛋白酶于37℃酶解24 h。

1.8 μRPLC－ESI－MS/MS 分析

μRPLC－ESI－MS/MS 分析條件如下所示。流動(dòng)相 A為98%水(含0.1%甲酸)，流動(dòng)相 B為98%乙腈(ACN，含0.1%甲酸)。其分離梯度如下:0 min，0%B;110 min，40%B;110.1 min，80%B;130 min，80%B;流速，5.0 μl·min－1。上樣體積為100 μl，上樣及除鹽時(shí)間為40 min。

LCQ儀器采用正離子模式，加熱毛細(xì)管溫度為150℃，噴霧電壓為3.0 kV，MS/MS掃描碰撞能量為35%?？傠x子流色譜圖質(zhì)量范圍為質(zhì)荷比(m/z)400～2000。MS/MS譜圖采用數(shù)據(jù)依賴模式，并且針對(duì)全掃描中前三個(gè)最高峰進(jìn)行MS/MS掃描。MS/MS數(shù)據(jù)采用基于SEQUST算法的BioWorks(版本號(hào)3.1)軟件檢索。檢索參數(shù)設(shè)置如下:數(shù)據(jù)庫(kù)，ipi MouseⅤ蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù);胰蛋白酶完全酶切，允許最大兩個(gè)漏切位點(diǎn);母離子的質(zhì)量容忍度為2 u;碎片離子的質(zhì)量容忍度為1 u。

2 結(jié)果

2.1 親和富集蛋白樣品分析

親和富集蛋白樣品的SDS－PAGE分析結(jié)果如圖1所示，可以看出PBST洗脫樣品中幾乎不含有蛋白(泳道2)，NaCl 1 mol·L－1洗脫樣品蛋白含量明顯高于PBST 洗脫樣品(泳道1)，說明NaCl 1 mol·L－1可以使保留于MTX－瓊脂糖凝膠上的蛋白解離被洗脫。

Fig.1 SDS－PAGE analysis of eluents from methotrexate－argarose after incubation of liver homogenate with the argarose beads.M:marker;lane 1:NaCl 1 mol·L －1 eluent;lane 2:PBST eluent.

2.2 親和富集蛋白μRPLC－ESI－MS/MS分析

將親和收集得到的蛋白樣品進(jìn)行超濾濃縮和溶液置換后以胰蛋白酶酶解蛋白樣品，酶解產(chǎn)物進(jìn)行μRPLC－ESI－MS/MS 分析，結(jié)果如圖2所示。通過檢索數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定樣品中蛋白種類如表1所示。在鑒定得到的蛋白質(zhì)中經(jīng)過2個(gè)肽段鑒定的蛋白為9個(gè)，其余蛋白為1個(gè)肽段鑒定。對(duì)得到的蛋白初步分類包括:代謝相關(guān)酶類(其中與一碳單位和葉酸代謝有關(guān)的有甲酰四氫葉酸脫氫酶、蛋氨酸合成酶、S－腺苷同型半胱氨酸水解酶)、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、腫瘤相關(guān)蛋白、與基因轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)蛋白及其他功能蛋白等。

Fig.2 μ HPLC analysis of trypsin digests of proteins eluted by NaCl.

Tab.1 Protein identification by μ HPLC－ESI－MS/MS analysis

3 討論

利用以鍵合化合物為配基的親和材料富集相互作用蛋白是研究化合物細(xì)胞內(nèi)蛋白靶點(diǎn)的常用方法，基于親和富集的化學(xué)蛋白組學(xué)方法即利用親和材料首先富集捕獲與配基相互作用的蛋白，再利用高通量質(zhì)譜分析方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。親和富集蛋白的第一步就是準(zhǔn)備親和色譜材料，瓊脂糖凝膠是一種常用的凝膠層析介質(zhì)，具有親水性、大孔性、非特異性吸附少等優(yōu)點(diǎn)，在分離生物大分子和基因工程產(chǎn)品下游工藝等領(lǐng)域具有廣泛的用途。本文采用的親和介質(zhì)材料是鍵合MTX的瓊脂糖凝膠，通過化學(xué)鍵合方法使MTX固載于凝膠表面，并在藥物分子與凝膠表面引入了適當(dāng)長(zhǎng)度間隔臂，從而減少可能存在的空間位阻效應(yīng)對(duì)藥物配基與靶蛋白相互作用的影響。

針對(duì)鑒定的蛋白，與MTX治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制可能相關(guān)、值得進(jìn)一步關(guān)注和研究的蛋白包括:S－腺苷同型半胱氨酸水解酶(S－adenosylhomocysteine hydrolase，SAHH)、蛋氨酸合成酶(betaine－h(huán)omocysteine methyltransferase)、干擾素誘導(dǎo)蛋白10受體(interferon－inducible protein 10)等。SAHH是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一種酶，它催化 S－腺 苷 同 型 半 胱 氨 酸 (S－adenosylhomocysteine，AdoHcy)水解生成腺苷和同型半胱氨酸，直接影響細(xì)胞內(nèi)AdoHcy、腺苷和同型半胱氨酸水平。有文獻(xiàn)報(bào)道類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者使用MTX后血液同型半胱氨酸水平升高[16－18]，提示 MTX 可能與AdoHcy水解酶相互作用，影響體內(nèi)同型半胱氨酸水平。關(guān)于MTX治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一個(gè)機(jī)制是通過增加體內(nèi)腺苷含量介導(dǎo)的，如使用MTX處理成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞可以使細(xì)胞外腺苷水平增加[19]。目前研究認(rèn)為MTX影響腺苷代謝的分子機(jī)制為 MTX抑制 5－氨基咪唑－4－甲酰胺核苷酸(5－aminoimidazole－4－carboxamide ribonucleotide，AICAR)轉(zhuǎn)甲酰酶，使細(xì)胞內(nèi)AICAR水平升高，進(jìn)而抑制AMP脫氨酶和腺苷脫氨酶，從而促進(jìn)AMP轉(zhuǎn)化生成腺苷[20]。本文結(jié)果提示 MTX可能與SAHH相互作用，直接影響細(xì)胞內(nèi)腺苷水平。AdoHcy是依賴S－腺苷甲硫氨酸的轉(zhuǎn)甲基酶的強(qiáng)效抑制劑[21]，SAHH已被選擇作為多種新藥研發(fā)的重要靶點(diǎn)，如免疫抑制劑、抗病毒藥、防治動(dòng)脈粥樣硬化和阿爾茨海默病藥物。目前還沒有報(bào)道MTX與SAHH相互作用。所以，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究MTX治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制及了解SAHH的功能提供了新的實(shí)驗(yàn)線索。

蛋氨酸合成酶催化同型半胱氨酸甲基化生成蛋氨酸，由甲基四氫葉酸提供甲基。使用大劑量MTX化療治療原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的改變是化療的典型副作用。而S－腺苷蛋氨酸是形成中樞神經(jīng)髓鞘的必需物質(zhì)，所以可以推論MTX與AdoHcy水解酶和蛋氨酸合成酶相互作用，繼而影響蛋氨酸代謝可能是其誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)改變的一個(gè)機(jī)制。

干擾素誘導(dǎo)蛋白10受體是由7個(gè)跨膜亞單位組成的膜結(jié)合分子，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族。干擾素誘導(dǎo)蛋白10與受體相互作用，通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)免疫細(xì)胞的遷移、活化，參與多種疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。MTX從20世紀(jì)50年代開始被試用治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，取得良好療效。到目前MTX已經(jīng)被作為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的首選，然而它的作用機(jī)制還不是很明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，干擾素誘導(dǎo)蛋白10受體很可能是MTX治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一個(gè)新的蛋白靶點(diǎn)。綜上所述，本文利用化學(xué)蛋白組學(xué)的原理和方法，以鍵合MTX的瓊脂糖凝膠為親和材料，利用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用鑒定了小鼠肝組織內(nèi)與MTX相互作用的潛在蛋白靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究MTX作用機(jī)制和毒理提供了實(shí)驗(yàn)線索和依據(jù)。

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