倪藝榕，郭周義，魏華江，劉智明，鐘會(huì)清

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院激光生命科學(xué)研究所、暨激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光子中醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631)

0 引言

關(guān)節(jié)透明軟骨組織解剖學(xué)的顯著特點(diǎn)就是其具有分層結(jié)構(gòu)［1］。在光鏡下，依據(jù)構(gòu)成軟骨的軟骨細(xì)胞及基質(zhì)(軟骨的基質(zhì)由膠原纖維、蛋白多糖和水三種物質(zhì)組成)中膠原排列為標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)節(jié)軟骨可分成4層:淺表層、移行層、輻射層、鈣化軟骨層［2］。切線層最薄約占軟骨厚度的5%～10%，移行層占軟骨厚度的40%左右，輻射層是軟骨最厚的部分，鈣化軟骨層為最深層，將軟骨和軟骨下骨質(zhì)分開(kāi)［1］。

軟骨細(xì)胞、膠原纖維、蛋白多糖和水這四種重要的構(gòu)成物質(zhì)在軟骨各層中不均勻分布［3］:軟骨細(xì)胞在切線層近似水平排列，長(zhǎng)軸與關(guān)節(jié)面平行，在移行層軟骨細(xì)胞近似圓形，散在分布，輻射層的細(xì)胞呈柱狀排列，鈣化軟骨層細(xì)胞非常少，被周圍鈣化組織包埋。膠原纖維在表層與關(guān)節(jié)面平行排列形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，移行層的膠原纖維呈斜行交錯(cuò)排列，輻射層的膠原纖維對(duì)與關(guān)節(jié)面呈垂直排列。蛋白多糖鑲嵌在膠原纖維形成的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)內(nèi)，表層的蛋白多糖含量較低，移行層的蛋白多糖濃度升高，輻射層的蛋白多糖濃度最高，鈣化層則不含蛋白多糖。水是關(guān)節(jié)軟骨中含量最豐富的成分，占軟骨濕重的65%-80%，水從軟骨面到軟骨下骨逐層降低［1］。

關(guān)節(jié)軟骨在構(gòu)成關(guān)節(jié)形態(tài)、維持生物力學(xué)特性方面具有重大作用［4］。關(guān)節(jié)的病變是由軟骨基質(zhì)的改變開(kāi)始［5］，比如骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是最易引起關(guān)節(jié)軟骨損傷的原因，該病晚期可致殘，嚴(yán)重危害中老年人的身心健康及生活質(zhì)量［6］。OA病理特征為關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)原發(fā)性或繼發(fā)性退行性病變。最初的病理變化為軟骨細(xì)胞功能不全，軟骨基質(zhì)各成分之間的比例失衡，出現(xiàn)軟骨面膠原纖維顯露，關(guān)節(jié)面粗糙不平。隨著OA病變的進(jìn)一步發(fā)展，骨髓腔開(kāi)放，新生的結(jié)締組織代替關(guān)節(jié)軟骨面，修復(fù)軟骨組織。與此同時(shí)，炎性介質(zhì)從滑膜釋放入關(guān)節(jié)腔，促使關(guān)節(jié)軟骨周緣骨贅形成，最終使關(guān)節(jié)喪失運(yùn)動(dòng)功能［7］。因此檢測(cè)監(jiān)控軟骨各層的改變?cè)陉P(guān)節(jié)病變的早期診斷中具有臨床意義。

但是在病變?cè)缙?，以軟骨損傷為主的病理改變很難被傳統(tǒng)影像學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槟壳芭R床常規(guī)使用的核磁共振和X片技術(shù)不能清晰地呈現(xiàn)軟骨組織分層結(jié)構(gòu)［1］。光學(xué)相干層析成像(OCT)技術(shù)是一種新型的，高分辨率的，非侵入性的檢測(cè)技術(shù)［8］。OCT技術(shù)能夠利用近紅外光產(chǎn)生組織的深度解析圖像，由于分辨率高，臨床上已經(jīng)將OCT廣泛用于角膜、皮膚組織的活體檢測(cè)［9］。已有研究提示OCT可以呈現(xiàn)明顯的皮膚層次結(jié)構(gòu)，這為關(guān)節(jié)軟骨的分層檢測(cè)提供了新思路。OCT能否反映軟骨組織學(xué)上的分層特點(diǎn)?軟骨不同層次間的物質(zhì)構(gòu)成變化是否能被OCT捕獲?為回答這一問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)以離體豬膝關(guān)節(jié)標(biāo)本為基礎(chǔ)，對(duì)照分析OCT軟骨掃描圖像分層表現(xiàn)與組織解剖學(xué)分層圖像的相關(guān)性，為實(shí)現(xiàn)OCT運(yùn)用于臨床早期關(guān)節(jié)軟骨病變?cè)\斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用豬離體關(guān)節(jié)標(biāo)本10例。關(guān)節(jié)取材為超市出售的新鮮的(死亡6小時(shí)內(nèi))豬后腿，豬齡1.5歲，體重平均60公斤，雄性。采用骨鉗截取5 mm×5 mm包括骨質(zhì)的軟骨樣本，在顯微鏡下篩選出無(wú)隱裂和損傷的關(guān)節(jié)軟骨20例。掃描前用0.9%NaCl溶液浸泡標(biāo)本，模擬關(guān)節(jié)滑液。

1.2 OCT圖像獲取及分析

本實(shí)驗(yàn)采用的OCT系統(tǒng)為全光纖維掃描系統(tǒng)［10，11］見(jiàn)圖1，中心波長(zhǎng)830 nm;帶寬40 nm;相干長(zhǎng)度10.7μm;系統(tǒng)靈敏度105 dB。在樣品表面標(biāo)記8個(gè)點(diǎn)，構(gòu)成4條直線作為OCT掃描路徑，每個(gè)樣本獲得連續(xù)的4副圖像。將所測(cè)的光學(xué)深度除以軟骨的折射率(1.3975 ± 0.0156)［12］，得到實(shí)際軟骨深度。主要的OCT觀察指標(biāo)一為，OCT對(duì)軟骨分層的成像能力;二為，OCT對(duì)軟骨厚度的評(píng)估。

1.3 組織學(xué)測(cè)量

在OCT掃描后依據(jù)標(biāo)記的掃描路徑獲得軟骨組織學(xué)樣本。10%甲醛固定2 h，脫鈣24 h。將組織塊用冰凍切片機(jī)快速切片，每例標(biāo)本5張。每張切片均在萊卡(DM2500)的40倍光鏡下分別測(cè)量軟骨組織整體厚度。軟骨組織上下界定義為軟骨表層至軟骨下骨皮質(zhì)區(qū)與軟骨深層交界處。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用excel2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，SPSS 11.0軟件對(duì)軟骨厚度進(jìn)行方差分析和pearson相關(guān)性分析，P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)節(jié)軟骨的OCT分層表現(xiàn)

圖1 OCT系統(tǒng)示意圖:SLD-超輻射發(fā)光二極管，C-瞄準(zhǔn)儀，DG-衍射光柵，F(xiàn)L-聚焦透鏡，DAQ-數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，VM-振動(dòng)鏡Fig.1 Schematic of spectral domain OCT system:SLD-super luminescent diode，CM-collimator，DG-diffraction grating，F(xiàn)L-focusing lens，DAQ-data acquisition system，VM-vibrating mirror

圖2為關(guān)節(jié)軟骨的OCT檢測(cè)圖像。軟骨表層呈現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)帶;表層下的移行層信號(hào)明顯減弱;第三層輻射層為性質(zhì)均勻的強(qiáng)信號(hào)區(qū)，該層的厚度最厚;鈣化層為一條強(qiáng)信號(hào)帶。本實(shí)驗(yàn)所采用的OCT系統(tǒng)能夠?qū)﹃P(guān)節(jié)軟骨的層次進(jìn)行成像。

圖2 關(guān)節(jié)軟骨的OCT圖像，顯示軟骨的四層結(jié)構(gòu)，顯示軟骨不同層級(jí)的不同構(gòu)象Fig.2 OCT graph of the articular cartilage，showing its four layers，the changes that take place in the formation of the cartilage

2.2 關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)分層表現(xiàn)

組織學(xué)依據(jù)Ⅱ型膠原排列規(guī)律和軟骨細(xì)胞分布形態(tài)可以確定軟骨組織分層。第一層為軟骨表層，該層膠原纖維致密，按切線方向排列形成致密薄層，亦稱為表面切線區(qū);第二層為移行層，膠原纖維細(xì)而均勻呈無(wú)序狀分布，細(xì)胞呈平行排列;第三層為輻射層，膠原纖維粗大，膠原纖維呈輻射狀排列，膠原細(xì)胞縱行排列;第四層為鈣化層，其膠原纖維呈網(wǎng)狀分布并延伸至皮質(zhì)骨表面，膠原細(xì)胞為球形或柱狀。本次組織學(xué)研究顯示，軟骨第一層即表層最薄，第三層輻射層最厚，見(jiàn)圖3。

圖3 軟骨的光學(xué)顯微鏡圖像(×40倍)，顯示軟骨的四層結(jié)構(gòu)，顯示軟骨不同層級(jí)的不同構(gòu)象Fig.3 Photomicrograph of the articular cartilage( ×40)，showing its four layers，the changes that take place in the formation of the cartilage

2.3 OCT關(guān)節(jié)軟骨測(cè)量厚度與組織學(xué)切片測(cè)量厚度的相關(guān)性

將同一樣本的相同部分的OCT圖像和組織學(xué)圖像進(jìn)行比較。OCT圖像可以清晰完整的呈現(xiàn)線形條狀帶的表層和鈣化層的影像，這與組織解剖學(xué)結(jié)構(gòu)一致，致密的表層與鈣化層都與周圍組織有明顯的分界線。OCT圖像的低信號(hào)區(qū)同均勻強(qiáng)信號(hào)區(qū)之間沒(méi)有明顯的分割線而呈現(xiàn)一種漸變的過(guò)程，這與組織解剖學(xué)的結(jié)果也是一致的，解剖圖像的移行層同輻射層之間的纖維及細(xì)胞的分布改變也是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，兩個(gè)層次間沒(méi)有明顯的分隔線。

OCT與解剖切片測(cè)量的軟骨厚度值(表層至鈣化層)見(jiàn)表1。經(jīng)方差分析，OCT獲得的深度值與顯微鏡測(cè)的結(jié)果接近，二者之間的差異無(wú)顯著意義(P＞0.05)。即OCT對(duì)深度的測(cè)量準(zhǔn)確性較好，可以對(duì)軟骨的縱深改變進(jìn)行評(píng)估。

表1 OCT與顯微鏡測(cè)量軟骨厚度值比較Tab.1 Comparison between the thickness of cartilage from optical coherence tomography and microscope

3 討論

3.1 關(guān)節(jié)軟骨組織解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

軟骨細(xì)胞、膠原纖維、蛋白多糖和水這四種重要物質(zhì)的構(gòu)成了軟骨［13，14］。其中，軟骨細(xì)胞約占軟骨體積的1%-2%，高度分化，但成年軟骨增殖能力差，在受到病理刺激后會(huì)發(fā)生增殖。軟骨細(xì)胞的主要功能是產(chǎn)生和維持細(xì)胞外基質(zhì)［13，15］。膠原在軟骨細(xì)胞周圍形成纖維網(wǎng)支架結(jié)構(gòu)，主要作用是承重和構(gòu)形［17］。膠原占軟骨干重的50%～60%，其中Ⅱ型膠原占軟骨膠原總量的90%～95%［16］，Ⅱ型膠原自軟骨表面隨深度的增加膠原成分逐漸減少。表層的膠原纖維與關(guān)節(jié)面平行形成的致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可允許小分子(某些離子和葡萄糖)通過(guò)，大分子(如蛋白質(zhì)、透明質(zhì)酸)不能進(jìn)入，故其為軟骨保護(hù)層。移行層的膠原纖維呈斜行交錯(cuò)排列。輻射層的膠原纖維對(duì)與關(guān)節(jié)面呈垂直排列。蛋白多糖鑲嵌在膠原纖維形成的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)內(nèi)，由于它是極端親水分子，故可以吸引大量水分子形成凝膠樣，使得關(guān)節(jié)軟骨富含水分，使其富有彈性并減少摩擦力［18］。軟骨表層的蛋白多糖含量較低，移行層的蛋白多糖濃度升高，輻射層的蛋白多糖濃度最高，鈣化層不含蛋白多糖。水是關(guān)節(jié)軟骨最豐富的成分，占軟骨濕重的65%-80%，水從軟骨面到軟骨下骨逐層降低［19］。切線層纖維與細(xì)胞平行精密排布水分基本無(wú)法透過(guò)，膠原纖維粘連蛋白和蛋白質(zhì)的水含量高。移行層的水含量降低，輻射層的水含量最低。

3.2 OCT對(duì)軟骨分層的呈現(xiàn)

OCT技術(shù)由于具有無(wú)輻射、無(wú)創(chuàng)傷、可定量、分辨率和敏感度高等優(yōu)越性，在眼科［20］、胃腸道［21］、心血管［22］、皮膚［23］等領(lǐng)域中已經(jīng)取得了多方面的進(jìn)展，也越來(lái)越受到臨床工作者的重視。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用OCT對(duì)關(guān)節(jié)軟骨樣本模型進(jìn)行了成像和定量分析，并將同一樣本的相同部分的OCT圖像和組織學(xué)圖像進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)所采用的OCT系統(tǒng)能夠清晰呈現(xiàn)軟骨的分層結(jié)構(gòu)。軟骨表面由于軟骨纖維同軟骨細(xì)胞構(gòu)成了致密的切線層，由于Fresnel反射呈現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)帶;表層下的移行層信號(hào)明顯減弱;第三層輻射層為性質(zhì)均勻的強(qiáng)信號(hào)區(qū)。OCT圖像的低信號(hào)區(qū)同均勻強(qiáng)信號(hào)區(qū)之間沒(méi)有明顯的分割線而呈現(xiàn)一種漸變的過(guò)程，這與組織解剖學(xué)的結(jié)果是一致的，解剖圖像的移行層同輻射層之間的纖維及細(xì)胞的分布改變也是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，兩個(gè)層次間沒(méi)有明顯的分隔線。最深層鈣化層為一條強(qiáng)信號(hào)帶。此外，OCT對(duì)深度的測(cè)量準(zhǔn)確性較好，可以對(duì)軟骨的縱深改變進(jìn)行評(píng)估。

綜上研究結(jié)果提示，將OCT應(yīng)用于軟骨的檢測(cè)，可以彌補(bǔ)目前臨床使用的關(guān)節(jié)病變常規(guī)檢測(cè)手段對(duì)呈現(xiàn)軟骨組織解剖分層結(jié)構(gòu)的不足。同時(shí)，可以對(duì)早期關(guān)節(jié)軟骨各層的變化及軟骨厚度的改變進(jìn)行定量，更便于臨床監(jiān)測(cè)和干預(yù)措施的效果評(píng)估。OCT系統(tǒng)對(duì)深度的測(cè)量具有較高的準(zhǔn)確性;隨著這項(xiàng)技術(shù)在臨床的推廣運(yùn)用，OCT必將成為早期關(guān)節(jié)病變臨床診斷的有力工具。

［1］MUEHLEMAN C，MAJUMDAR S，ISSEVER A S，et al.X-ray detection of structural orientation in human articular cartilage［J］.Osteoarthritis Cartilage，2003，12(2):97-105.

［2］YOSHIOKA H，HAISHI T，UEMATSU T，et al.MR microscopy of articular cartilage at 1.5 T:orientation and site dependence of laminar structures［J］.Skeletal Radiology，2002，31(9):505-510.

［3］HUBER M，TRATTNIG S，LINTNER F.Anatomy，biochemistry，and physiology of articular cartilage［J］.Investigative Radiology，2000，35(10):573-580.

［4］BONIFACIO A，BELEITES C，VITTUR F，et al.Chemical imaging of articular cartilage sections with Raman mapping，employing uni-and multi-variate methods for data analysis［J］.Analyst，2010，135(12):3193-3204.

［5］AIGNER T，MCKENNA L.Molecular pathology and pathobiology of osteoarthritic cartilage［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2002，59(1):5-18.

［6］REGAN E，F(xiàn)LANNELLY J，BOWLER R，et al.Extracellular superoxide dismutase and oxidant damage in osteoarthritis［J］.Arthritis Rheum，2005，52(11):3479-3491.

［7］RUTGERS M，SARIS D B，YANG K G，et al.Joint injury and osteoarthritis:soluble mediators in the course and treatment of cartilage pathology［J］. Immunotherapy， 2009，1(3):435-445.

［8］HUANG D，ZHANG W，ZHONG H，et al.Optical clearing of porcine skin tissue in vitro studied by Raman microspectroscopy［J］.J Biomed Opt，2012，17(1):015004.

［9］ZHONG H，GUO Z，WEI H，et al.In vitro study of ultrasound and different-concentration glycerol-induced changes in human skin optical attenuation assessed with optical coherence tomography［J］.J Biomed Opt，2010，15(3):036012.

［10］XIONG H L，GUO Z Y，LI S X，et al.in vivo detection of Hirschsprung's disease by optical coherence tomography in rats［J］.Physics in Medicine and Biology，2013，58(5):1549-1561.

［11］SHEN Z Y，WANG M，JI Y H，et al.Transverse flow velocity quantification using optical coherence tomography with correlation［J］.Laser Physics Letters，2011，8(4):318-323.

［12］WANG K，WU J，DAY R E，et al.Utilizing confocal microscopy to measure refractive index of articular cartilage［J］.Journal of Microscopy，2012，248(3):281-291.

［13］ALMONTE-BECERRIL M，NAVARRO-GARCIA F，GONZALEZ-ROBLES A，et al.Cell death of chondrocytes is a combination between apoptosis and autophagy during the pathogenesis of Osteoarthritis within an experimental model［J］.Apoptosis，2010，15(5):631-638.

［14］HAJJAJI H E，WILLIAMS J M，DEVOGELAER J P，et al.Treatment with calcitonin prevents the net loss of collagen，hyaluronan and proteoglycan aggregates from cartilage in the early stages of canine experimental osteoarthritis［J］.Osteoarthritis Cartilage，2004，12(11):904-911.

［15］PUDLAS M，BRAUCHLE E，KLEIN T J，et al.Non-invasive identification of proteoglycans and chondrocyte differentiation state by Raman microspectroscopy［J］.J Biophotonics，2013，6(2):205-211.

［16］LEMOINE J K，LEE J D，TRAPPE T A.Impact of sex and chronic resistance training on human patellar tendon dry mass，collagen content，and collagen cross-linking［J］.American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology，2009，296(1):R119-R124.

［17］SHEPHERD J H，GHOSE S，KEW S J，et al.Effect of fiber crosslinking on collagen-fiber reinforced collagen-chondroitin-6-sulfate materials for regenerating load-bearing soft tissues［J］.Journal of Biomedical Materials Research，Part A，2013，101A(1):176-184.

［18］LI J J，SUN H，SUN D，et al.Biomimetic multicomponent polysaccharide/nano-hydroxyapatite composites for bone tissue engineering［J］.Carbohydrate Polymers，2011，85(4):885-894.

［19］LEONE G，BIDINI A，LAMPONI S，et al.States of water，surface and rheological characterisation of a new biohydrogel as articular cartilage substitute［J］.Polymers for Advanced Technologies，2013，24(9):824-833.

［20］RODRIGUES E B，MEDEIROS F，MENNEL S，et al.Optical coherence tomography in ophthalmology［J］.Journal of Ophthalmology，2012，134569

［21］TESTONI P A，MANGIAVILLANO B.Optical coherence tomography in detection of dysplasia and cancer of the gastrointestinal tract and bilio-pancreatic ductal system［J］.World Journal of Gastroenterology，2008，14(42):6444-6452.

［22］RABER L，RADU M D.Optimising cardiovascular outcomes using optical coherence tomography-guided percutaneous coronary interventions［J］.Eurointervention，2012，8(7):765-771.

［23］ALAWI S A，KUCK M，WAHRLICH C，et al.Optical coherence tomography for presurgical margin assessment of non-melanoma skin cancer-a practical approach［J］.Experimental Dermatology，2013，22(8):547-551.